我国海南省虫媒病毒的分离与鉴定，2017-2018

发布时间：2020-03-17 21:03

【摘要】：背景虫媒病毒是一类由蚊、蜱、白蛉、蠓等吸血昆虫传播,通过叮咬引起人畜疾病的病毒,该病毒能够引起自然疫源性疾病和人兽共患病。虫媒病毒结构较简单,一般是RNA病毒,外层有包膜结构。虫媒病毒进入吸血昆虫体内,并在体内增殖且不会使昆虫致病,然后再通过昆虫叮咬动物转入宿主,并大量繁殖,引发相关临床病症。50年代只发现35种,1974年在国际虫媒病毒中心登记的已达359种,截至1989年发展为532种,其中125种对人畜致病,某些病毒可引起严重的疾病,如脑炎、失明等。虫媒病毒呈全球分布,主要在中温带、亚热带和热带。我国的虫媒病毒研究起步较晚,目前已经分离出的病毒有乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、新疆出血热病毒、登革热病毒、西尼罗病毒、盖塔病毒、版纳病毒等。我国存在多种虫媒病毒,但我国地域广阔,环境复杂,物种繁多,为进一步进行虫媒病毒的调查与研究提出了挑战。我国蚊虫及蠓虫种类繁多,分布广泛,是十分重要的类群。从上世纪50年代我国就开展对蠓研究直到现在,随着研究的逐步深入,蠓的新种的发现不断地被报道。尤其是吸血蠓类与人畜关系密切,而且有些蠓种是人畜共患病的重要传播媒介,一方面可引起动物性疾病,给畜禽业造成严重的经济损失,另一方面也给人类健康带来巨大威胁。研究表明大多数蚊媒传染病都是由三种蚊子传播的:伊蚊、按蚊和库蚊。伊蚊属中的物种,特别是白纹伊蚊和埃及伊蚊是许多人畜共患疾病的载体,包括登革热病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒和黄热病。按蚊主要传播疟疾和一些其他病原体,例如能引起丝虫病的犬心丝虫。库蚊主要是尖音库蚊、跗斑库蚊和三带喙库蚊,携带并传播西尼罗河病毒和圣路易斯脑炎病毒。所有三个属中的蚊子范围都在不断扩展。其中埃及伊蚊是最普遍的,通过反复入侵几乎在全球都有分布。随着蚊子种类扩大其地理分布,它们所带来的疾病正在扩大,并且预计会继续扩大,这对以前未受影响的地方来说是一个新的挑战。海南位于东经108°37'-117°50',北纬3°58'-20°20',北隔琼州海峡与广东省雷州半岛相望;西临北部湾;南达曾母暗沙,与马来西亚为邻;东南濒临太平洋,与菲律宾、印度尼西亚等相望,属于热带季风气候,存在虫媒病毒繁殖和传播的天然条件。海南省是流行性乙型脑炎和登革热的流行区,曾于2000年在三亚市及乐东县出现乙脑暴发疫情,而且早在1985年便分离出4株乙脑病毒(JEV);海南曾于1979、1980-1991年发生过登革热大流行,并于1989年分离出登革热2型毒株;此外,还分离到多种甲病毒、黄病毒等其他病毒。随着海南省旅游业的迅猛发展,使人员流动增多,同时也为虫媒病毒的输入以及多样性提供了条件,但是近三十年来尚未在海南省开展过系统性的虫媒病毒调查研究,为了了解海南省蚊虫种类以及分布特征是否有所变化,当地吸血昆虫携带病毒的种类以及流行特点是否有所改变,因此本研究所选采集点为此前分离到病毒及发生过乙脑及登革热大流行等疫情的地区,并于2017、2018年连续2年对海南省6个市县进行系统的蚊虫和蠓虫标本采集和虫媒病毒的调查研究。对预防和控制当地虫媒病毒病,为今后制定相应的防治和控制措施,避免疫情扩大流行具有重要意义。目的对海南省6个市县夏季蚊虫和蠓虫种类和数量分布情况进行系统调查,了解当地主要吸血昆虫蚊虫及蠓虫所携带的虫媒病毒。为当地虫媒病毒及相关人畜疾病的预防与控制提供基础数据。方法2017、2018年8月份在海南省6个市县的村庄选择人舍和动物饲养圈(牛圈、羊圈、猪圈等)蚊虫滋生环境设置采样点进行蚊虫标本采集。对所采集的标本在冰排上进行形态学分类及鉴定,按照采集地区、采集日期、孳生环境以及蚊虫种类、数量等基本信息进行编号登记,立即放入液氮中保存并运送至实验室进行分离与鉴定。在实验室对所采集标本进行研磨、离心和分装,研磨上清液平行接种BHK-21细胞(金黄色地鼠肾细胞)和C6/36细胞(白纹伊蚊卵细胞)进行病毒分离,同时制备海南省蚊虫标本的cDNA文库,采用RT-PCR法进行特异性核酸筛检。细胞出现病变作用(CPE)时收取病毒液并使用分子生物学方法对阳性分离物进行分子生物学鉴定,结果使用多种软件对病毒基因组核苷酸序列进行序列同源性分析及分子遗传学分析。结果在2017年和2018年的8月份,在海南省儋州市、澄迈县、文昌市、昌江黎族自治县、东方市、乐东黎族自治县共采集到4属(库蚊、阿蚊、伊蚊、按蚊)7种15097只蚊虫和11360只待鉴定蠓虫。采集的蚊虫包括三带喙库蚊13990只,占蚊虫采集总数92.67%(13990/15097),此外还采集到阿蚊780只,白纹伊蚊37只,按蚊37只。可见三带喙库蚊是以上采集点的优势蚊种。2017年8月18日~8月21日,在海南省儋州市、澄迈县、文昌市三个地区共采集到19604只已鉴定蠓虫,包括1属22种(荒川库蠓、异域库蠓、尖喙库蠓等)。其中儋州市采集到的蠓种以尖喙库蠓、黄胸库蠓为主,分别为3593、1640只,占儋州市库蠓总数的40.5%(3593/8872)、18.55%(1640/8872),可见尖喙库蠓为当地优势蠓种;澄迈县采集到的蠓种以黄胸库蠓、荒川库蠓为主,分别为887、529只,占澄迈县库蠓总数的33.2%(887/2673)、19.8%(529/2673),可见黄胸库蠓为当地优势蠓种;文昌市采集到的蠓种以异域库蠓、荒川库蠓为主,分别为3102、2102只,占文昌市库蠓总数的38.5%(3102/8059)、26.1%(2102/8059),可见异域库蠓为当地优势蠓种。总体来说,尖喙库蠓、荒川库蠓占比较大,分别占库蠓总数的28.1%(5499/19604)、18.3%(3589/19604)。所有蚊虫(162批)和待鉴定蠓虫(37批)标本共为199批次,儋州市、澄迈县、文昌市、昌江黎族自治县、东方市、乐东黎族自治县分别为75批、63批、30批、9批、8批和14批。经实验室常规处理后接种BHK-21细胞和C6/36细胞,共获得4株可以稳定传代的病毒分离物,经分子生物学检测与鉴定其中3株病毒为乙脑病毒,均属于基因1型乙脑病毒(均来自三带喙库蚊),1株盖塔病毒(分离自三带喙库蚊),蠓虫标本未获得病毒分离物。使用12种病毒属特异性和种特异性病毒基因扩增引物对199批标本研磨液进行病毒基因扩增,结果为蚊虫标本均为阴性,而在5批蠓虫标本中获得OYA病毒基因扩增阳性,全部于猪圈中采集得到,其中4株来自于儋州市,1株来自于澄迈县。结论本研究于2017和2018年夏季连续在我国海南省选取6个市县进行虫媒病毒的调查研究,共采集到4属7种15097只蚊虫和11360只待鉴定蠓虫,其中三带喙库蚊为当地优势蚊种。本次蚊虫标本共研磨199批,共分离到4株可以稳定传代的病毒分离物,均分离自三带喙库蚊,均来自儋州市,其中三株为JEV,且均为基因I型,另一株为GETV,提示当地仍然存在乙脑病毒在自然界的循环。此外,在海南省采集的多批蠓虫标本中检测到阿卡斑病毒基因扩增阳性,这是首次在海南省自然界采集的吸血昆虫标本中发现阿卡斑病毒的存在,对当地动物疾病的预防控制提出新的挑战。
【图文】：

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图 1.1.1 海南省吸血昆虫标本采集地点Figure 1.1.1 The collection sites of blood sucking insects in Hainan province注：表示 2018 年吸血昆虫标本采集点；表示 2017 年吸血昆虫采集点。1.2 采集工具本研究采集吸血昆虫所用到的主要工具为“功夫小帅”牌紫外诱蚊灯（WuhanLucky Star Environmental Protection Technology Co., Ltd., Hubei, China）、牛帐（以一只牛做诱饵，外围搭蚊帐诱捕蚊虫标本，长 4 米、宽 4 米、高 1.8 米）。由于蚊虫对温度敏感，具有趋光性，习惯群聚。因此诱蚊灯能够高效捕蚊，将诱蚊灯悬挂在人房、猪圈、牛圈、鸡圈等易于蚊虫滋生的环境，诱蚊灯悬挂距离地面大约 1.5 米，蚊虫比较密集，其它采集工具包括：吸蚊器、蚊笼、电池、手电筒、蚊虫收集网、剪刀、镊子、冰排、平皿、冻存管、记号笔、信息采集表、胶布、放大镜、液氮罐、滤纸。1.3 吸血昆虫标本的处理

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图 1.1.2 海南省采集吸血昆虫标本的构成Figure 1.1.2 Composing of blood sucking insects collected in Hainan province所述，海南省属于热带季风气候，年平均气温为 22~26℃，雨量充沛约为 1639 mm，湿度高，地形地貌复杂，其自然条件非常适宜蚊虫的孳生密度最大，，本研究在 2017、2018 年 8 月份在海南省多个县市开展虫，既保证了采集蚊虫的数量，也可以在一定程度上反映海南省蚊虫种研究在海南省共采集到共采集到 4 属（库蚊、阿蚊、伊蚊、按蚊）7 种 1 11360 只待鉴定蠓虫。包括包括阿蚊、白纹伊蚊、按蚊、三带喙库蚊11360只蠓虫，其中以三带喙库蚊居多，为 13990只，占蚊虫采集总数 92/15097）。是当地的优势蚊种。经过调查发现，当地农村的耕地以种植般数十户农户所组成的村落位于大面积水稻周围，而且农户家中大多鸡，羊等家养动物。各种动物畜圈位于农户的庭院中，使得人畜的生
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R384.1

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