新型定位探针介导剪切的等温指数扩增方法研究

发布时间：2020-03-18 23:59

【摘要】：癌症的过程研究阐明了癌症的发生、发展及其演变过程中的相关机理,对癌症的诊断、干预和治疗具有指导性作用,其中,对癌症的相关生物标志物的检测是癌症的过程研究中最有效的途径之一。核酸是一种非常重要的癌症标志物,对其进行有效筛查和高灵敏检测对癌症的过程研究和控制具有十分重要的意义。因此,对复杂样品中的痕量核酸进行扩增和检测受到了越来越多的关注,尤其是核酸等温扩增技术。自1990年以来,大量的核酸等温扩增方法被陆续开发出来,并且被广泛应用于DNA、RNA和蛋白质等的检测。其中,基于切口内切酶(Nicking Endonucleases,NEases)的等温扩增方法,如链置换扩增(Strand Displacement Amplification,SDA)、指数等温扩增反应(Exponential Isothermal Amplification Reaction,EXPAR)和切口内切酶信号放大(Nicking Endonuclease SignalAmplification,NESA)等由于简单、快速、高效等优点始终是近年来的研究热点。但是,NEases对目标核酸分子中特定识别序列的依赖构成了这类方法的瓶颈,因此,如何向扩增体系中引入NEases的特异性识别位点仍是这些方法面临的共同挑战;另外,对制约等温扩增方法检测灵敏度的非特异性扩增效应的有效抑制也是非常棘手的难题。针对上述问题,本论文首先发展了一种DNA定位探针(DNA-Aligner,DA)介导剪切技术(Aligner-MediatedCleavage,AMC),克服了 NEases对目标核酸分子中特定识别序列的依赖问题;在此基础上,提出了基于AMC的两种新型等温指数扩增方法,并对新方法中存在的非特异性扩增效应进行研究和抑制,进一步提高了方法的稳定性和灵敏度;此外,还利用DA介导的等温扩增反应和空间位阻效应建立了一种简便、快速和均相的蛋白检测方法。主要研究内容包括以下几个方面:第一章概述了近年来发展的主要等温扩增方法。重点阐述、分析了基于NEases的等温扩增方法的原理、应用和存在的问题,并在此基础上提出了本论文的研究内容。第二章发展了一种定位探针介导剪切技术(AMC)。定位探针(DA)包括茎-环结构和两单链侧臂,其中茎上含有NEases的识别位点;NEases首先结合在DA茎的识别位点上,再通过DA两侧臂与目标序列的杂交被定位至待剪切位点处进而实施剪切。该方法克服了 NEases对目标核酸分子中特异性识别位点的依赖,仅使用一种NEase,通过调节DA在目标序列上的杂交位置就可以实现在任一位置处的精确剪切,且剪切位点可以逐个碱基调节。第三章采用AMC技术发展了一种新型等温链置换扩增方法(Aligner-Mediated Cleavage-Based Strand Displacement Amplification,AMC-SDA)。相较于传统的SDA,AMC-SDA具有以下特点:由于AMC优异的通用性,该方法也具备很强的通用性,理论上可以实现对目标序列中的任一片段的扩增和检测;引物的3'封端处理在一定程度上抑制了“引物二聚体”效应,可以获得较高的灵敏度,此外引物设计也因此大幅简化。对质粒和实际HBVDNA良好的检测性能证明了AMC-SDA具有很好的应用前景。第四章对AMC-SDA进行了优化,进一步提高了方法的检测灵敏度和重现性。通过对DA的改进和在引物中引入硫化和脱碱基位点等手段,消除了 DA/引物沿着目标序列延伸对阳性扩增的不利影响、抑制了 DA/引物3'封端的降解和体系的非特异性扩增效应,可将AMC-SDA的检测下限降低至10-17M水平,且方法的重现性也大幅提高。第五章采用AMC技术发展了一种新型指数等温扩增方法(AMC-Triggered Exponential Amplification,AMCEA)。相较于传统 EXPAR,由于 AMC 可以在任一位点处将目标序列剪切以产生触发引物,因此AMCEA具有十分优异的通用性,可以更灵活地应用于各种核酸片段的扩增和检测,其对血清中目标DNA的检测结果也证明了该方法具有一定的应用潜力。第六章将DA可调节等温扩增反应速率的特性与空间位阻效应相结合,提出了一种空间位阻效应调节的等温扩增方法(Steric Effect-RegulatedEXPAR,SER-EXPAR)并用于蛋白质的检测。SER-EXPAR可以高特异性地检测纳摩尔浓度的目标蛋白,是一种一步、快速和均相的蛋白检测方法,其对血清中目标蛋白的检测结果也证明了该方法具有一定的应用潜力。第七章对本论文的创新点进行总结并对以后的研究提出了展望。
【图文】：

示意图,技术原理,示意图,连接酶

另一种重要的变温妒■增技术是连接酶链式反应（Ｌｉ邋ｇａｓｅ邋Ｃｈａｉｎ邋Ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＬＣＲ邋），逡逑由Ｂａｒａｎｙ于１９９１年发明［１３，１４］，主要目的是检测靶序列中的基因位点突变，其基逡逑本过程如图１．２所示。耐热型（９４。０连接酶的使用不但抑制了邋ＬＣＲ的非特异逡逑性扩增，还避免了与早期ＰＣＲ类似的不断补充酶的复杂操作过程。ＬＣＲ是检测逡逑靶序列中有无突变的最佳方法之一，目前主要用于癌症基因的点突变、单碱基遗逡逑传病多态性的研究、定向诱变以及微生物病原体的检测等［１５邋＿邋１７１。逡逑完伞Ｉｆ．补靶序《逦屾ｆｆｉ错配序列逡逑Ｋ邋ｉＨＣ．受性－＾逦；邋Ａ逦，邋－ｙ邋ｓ逦逦逦：＝＾＝＾邋ｙ逡逑＝逦ｊ邋＾逦ｒ逦逦．！邋ｆ逡逑舫ｔ退火聚交逦？逦＾逡逑ＶＳ－邋ＶＸ邋＇Ｏ－Ｊｉ邋逦ｉ逦Ｊ邋Ｃ７？■—邋．＇Ｊ逡逑Ｊ＝｜＝２＝３邋５逦￣邋＇逦逦＾逡逑２、

示意图,原理,示意图,连接酶

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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.4;R3416

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