白介素-1受体辅助蛋白单链抗体的筛选与鉴定

发布时间：2020-03-19 16:19

【摘要】：白介素-1受体辅助蛋白(Interleukin-1 Receptor Accessory Protein,IL1RAP)是参与白介素-1家族因子多种信号传导途径的共受体。其中,IL1RAP在慢性髓性白血病的干细胞表达,但在正常造血干细胞中不表达;在急性髓性白血病和骨髓增生异常综合征患者的原始细胞上,IL1RAP的表达量也显著增加。IL1RAP已被证明可作为多种癌症的细胞表面标志物,尤其是血液癌症。因此,以IL1RAP为靶点开发抗体药物治疗白血病具有乐观前景。利用柔性多肽链将抗体的重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)连接形成单链抗体(scFv),既保留了与抗原发生特异性结合的最小结构单元又降低了免疫排斥反应,在免疫治疗领域极具应用优势。本课题综合利用噬菌体展示技术和酵母表面展示技术从人源化的单链抗体库中筛选针对IL1RAP靶点的单链抗体,并分析其特性。我们首先利用链霉亲和素与生物素结合的原理,将人源单链抗体库经过2轮噬菌体淘选,利用ELISA检测确定2轮淘选后的抗体库具有明显的阳性富集。富集的噬菌粒载体经酶切纯化获得scFv片段,构建成为酵母展示亚文库。利用Aga1-Aga2的酵母展示系统经过3轮酵母表面展示及流式细胞分选,逐级富集高亲和力的单链抗体。筛选获得的IL1RAP单链抗体片段经DNA测序确定其序列。将筛选得到的IL1RAP单链抗体DNA克隆到pFuse载体,利用293F细胞表达含Fc段的scFv蛋白。单链抗体经protein A蛋白柱亲和层析纯化。同时,我们利用CRISPR-Cas9编辑技术敲除IL1RAP,获得了不表达IL1RAP的293F稳定细胞株。利用IL1RAP敲除株和野生型293F细胞验证候选单链抗体结合IL1RAP的特异性,最终获得2个具有较高亲和力的IL1RAP单链抗体序列。综上,本课题通过噬菌体和酵母展示筛选技术获得了针对IL1RAP靶点的单链抗体,证实筛选得到的单链抗体与IL1RAP具有良好的亲和力。为靶向IL1RAP蛋白的白血病等疾病免疫治疗奠定了良好基础。
【图文】：

细介绍了 IL-1R 家族的 10 种受体的命名以及作用机制，，IL-1α、I 以及 IL1RAP 引发免疫炎症反应；IL-18 结合 IL-1R7 引发炎症反应4、IL1RAP 引发炎症反应；IL-36α、IL-36β、IL-36γ 结合 IL-1R6 与 应。族的促炎性因子（除 IL-18），在进行信号传导过程中，首先与细结合形成受体复合物结构，但此时并不具备向细胞内传递信号的能表面的共有结构白介素-1 受体辅助蛋白（IL1RAP，又称 IL-）形成异源三聚体结构进而进行信号传递，引发细胞的炎症反应[5]（

刺激小鼠后并没有产生人们预期的特异性抗体[14]。这些问题的存在单链抗体的研究与开发。抗体分子由 4 条多肽链构成，包括 2 条重链和 2 条轻链，链与链之当完整的抗体分子经木瓜蛋白酶消化后，得到两个完整的抗原结合由重链恒定区 2 和 3 组成的 Fc 段。Fab 片段还能够通过酶解的方结构单位 Fv。Fv 片段由抗体分子的重链可变区（VH）与轻链可变价键连接，是与抗原发生特异性结合的最小结构单元。而单链抗体因工程的手段得到的，它是利用一个柔性的多肽链将抗体分子的重变区连接在一起，并且这条多肽链需包括至少 12 个氨基酸残基，体与抗原结合的三维构象[15]。最常用的连接肽链是甘氨酸与丝氨。
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392

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本文编号：2590451