果蝇后肠发育信号调控机制及细胞谱系模式研究

发布时间：2020-03-20 03:06

【摘要】：模式生物果蝇是研究疾病及器官发育机制的重要模型。果蝇肠道和人类具有高度相似性,以果蝇肠道为研究对象可为揭示人类肠道疾病发生及损伤修复机制提供重要的参考。目前为止,关于果蝇中肠的发育机制已有很多深入的研究,而果蝇后肠的研究却相对较少。果蝇后肠形成过程中受哪些重要的信号调控?在蛹期器官解离和成虫组织重构的过程中,幼虫后肠肠细胞的命运如何,是发生凋亡还是存活下来并参与成虫后肠的重构?目前这些关于后肠相关功能机制的探究都少为人熟知。我们都知道干细胞负责调控所在部位的组织命运和器官维护,那后肠干细胞在组织受损时将如何修复损伤?Gal4/UAS系统是果蝇中常用的转基因体系,利用Gal4/UAS系统可以实现区域化的灵活操控的靶基因表达。为了更清晰地示踪细胞谱系的增殖分化模式和细胞群落的迁移分布状态,本研究使用新的遗传学细胞谱系示踪技术:G-TRACE(Gal4 technique for real-time and clonal expression)技术,即在Gal4/UAS系统的基础上结合FLP(flipase)-out技术和荧光蛋白标记技术,可以清楚地分析发育过程中的细胞谱系模式。本研究将利用G-TRACE技术探究后肠的肠细胞发育谱系及其形成的信号调控机制、干细胞在受损后肠中的修复模式。主要研究内容如下:一:利用G-TRACE技术追踪果蝇后肠肠细胞谱系的发育模式采用黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)engrailed-Gal4(en-Gal4)品系和G-TRACE品系杂交,同时引入tub-Gal80~(ts)控制Gal4的开启时间,分别在果蝇幼虫期和蛹期开启细胞谱系追踪。幼虫期追踪:亲代产卵后将卵置于30℃培养,3龄中后期转入18℃培养,成虫羽化1 d内解剖肠道并观察。蛹期追踪:亲代产卵后将卵置于18℃培养,在蛹期不同发育阶段转入30℃培养,待虫体羽化后检测成虫肠道的追踪情况。当在果蝇幼虫期启动细胞谱系追踪,在蛹期停止追踪,发现成虫中肠靠近中后肠边界处以及马氏管存在绿色肠细胞。而当在果蝇幼虫期关闭细胞谱系追踪,在蛹期开始追踪,则发现虫体中肠各部位及马氏管分布着绿色肠细胞,en基因在果蝇蛹期的肠道表达。结果表明在果蝇蛹形成过程中,幼虫期后肠肠细胞并非完全凋亡,而是有一部分迁移至中肠或马氏管,参与成虫中肠或马氏管的重塑。二:G-TRACE手段追踪果蝇后肠形成的信号调控机制Sheng-An Yang等认为幼虫的“成虫环”区域(文中称为“the imaginal ring”,位于后肠幽门)是幼虫组织中的祖细胞区,影响着成虫后肠组织的生成。以hh--Gal4,wg-Gal4,ptc-Gal4,ci-Gal4,dpp-Gal4,notch-Gal4品系分别与G-TRACE品系杂交,同时引入tub-Gal80~(ts)控制Gal4的开启时间。对杂交子代的幼虫及成虫模式、追踪幼虫期激活的GFP细胞(基因表达细胞)后最终对成虫后肠组织的贡献量等做出分析探究。最终我们得出结论,幼虫期ci表达的区域即定位于“成虫环”,也就是幼虫的祖细胞区,幼虫期Hh信号在幽门部位紧邻“ci祖细胞区”检测到,Wg和Dpp(Ptc)信号位于成虫后肠增殖区(hindgut proliferation zone,HPZ),Wg和Dpp(Ptc)信号之间可能互相有关联并作用于成虫后肠增殖区。三:后肠损伤组织的修复机制对后肠肠细胞的命运及其形成的信号调控机制做分析结论之后,我们接着探究果蝇后肠干细胞对损伤组织的修复机制。研究采用bam-Gal4,vasa-Gal4,wg-Gal4品系驱动G-TRACE品系,引入tub-Gal80~(ts)控制Gal4的开启和关闭。用20%-40%浓度梯度的NaCl溶液加入培养基中对果蝇成虫进行损伤,并用生殖细胞(Germline Cells)标记物对“wg环”区域进行检测,“wg环”区域也即是位于成虫HPZ区。最终研究结果显示,由无NaCl溶液加入的正常培养基饲养的果蝇后肠“wg环”区域并未检测到生殖细胞标记物,并且在成虫后肠组织中也未发现表达EGFP的wg细胞,因正常状态下后肠组织中的干细胞处于静默状态。而被NaCl溶液损伤的后肠解剖后不仅检测到生殖细胞标记物,同时在后肠组织中发现了表达EGFP的wg细胞的移动行迹,EGFP细胞流以特殊的轨道形式向后肠后部部位移动,可见肠道干细胞在行使其功能时是沿着一定的移动轨迹来修复补充受损部位的。
【图文】：

在世界各地均可以寻找到其描述以来，以黑腹果蝇（Drosophil为了人类最为青睐的手段之一。黑腹Diptera）昆虫，具有完全变态，其下，10 天就可以完成一代的繁殖（龄 1 天，二龄 1 天，三龄 1 天），，后破蛹羽化为成虫[2-3]。以黑腹果蝇，使用经济：在常温条件下使用较且子代多：缩短了实验周期，使实验全：只有 4 对染色体，另外还有许数次的杂交, 确定了基因里面的基因4. 与人类有很大关联：关于果蝇的这些优势都使得黑腹果蝇成为最常用

果蝇后肠发育信号调控机制及细胞谱系模式研究 Gal4/UAS 系统为基础统统是果蝇实验研究中最常用的转基因系之一。其基本子，使得靶标基因可以特异性的在特定部位进行表达统构成：Gal4 转基因系和 UAS 转基因系[11]，Gal4 体系中独立存在[7-8]。Gal4（Galactose 4）是一种转录员发现果蝇 Gal4 可以激活 UAS（upstream activatin-9]。UAS 是上游激活序列，是酵母中类似于真核生物的识别并结合 DNA 序列 UAS 的特异性位点并激活 UAS 品系杂交以获得两种转基因序列是实验常用独特优势之处[10-11]。
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R-332

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本文编号：2591147