恶性疟原虫脂酰辅酶A合成酶在青蒿素抗性中的作用及其分子机制

发布时间：2020-03-20 04:38

【摘要】：疟疾是由疟原虫感染引起的一种寄生原虫病。这种古老的寄生虫病至今仍然在全球104个国家肆虐流行,约33亿人口受到威胁。尽管人们为消除疟疾作出了巨大努力,但该疾病依然给疟疾流行区(特别是非洲地区)人们的生命健康造成巨大威胁。由于目前尚无有效的商品化疫苗用于疟疾预防,因此治疗疟疾的主要手段仍然是抗疟药物。但随着这些药物的广泛应用,很多流行区不可避免地出现了疟原虫抗药性问题,尤其是在东南亚地区,恶性疟疾曾出现各类抗疟药物的抗性虫株并迅速在世界范围内蔓延,使得疟疾患病率和死亡率大大增加,这对全球的疟疾防治和消除形成巨大威胁。世界卫生组织于2005年推荐青蒿素联合用药(Artemisinin-based combination therapy,ACTs)作为一线疗法在全球范围内推广应用。该药物具有起效快、毒副作用小等特点,在疟疾流行地区有效地遏制了疟疾传播。然则2006-2007年,湄公河流域出现了以感染患者体内虫体清除时间延长为特征的青蒿素抗性虫株并迅速扩散,抗性虫株的出现引起了科学家的担忧,疟疾的消除计划再次面临严峻的挑战。当前亟待解决的难题是恶性疟原虫究竟是通过何种分子机制来产生青蒿素抗性。Ariey等人的前瞻性研究表明:恶性疟原虫13号染色体上的Pfkelch13(K13)基因上某些氨基酸位点的突变与青蒿素抗性之间存在紧密联系。后续Mbengue等人发现双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)能够抑制恶性疟原虫磷脂酰肌醇激酶(PfPI3K)的活性使其催化生成的磷脂酰肌醇(PI3P)减少,信号通路激活不完全,对虫体产生致命损伤;同时K13的基因突变导致与PfPI3K的结合减少,PfPI3K泛素化降解减少使其在虫体中积聚,导致其催化生成的PI3P量显著升高,虫株的抗性增强。这些研究提示PfK13-PfPI3K相互作用在青蒿素抗性机制中发挥作用,但具体的信号通路和分子机制仍不清楚。本课题旨在进一步探索恶性疟原虫青蒿素抗性产生的分子机制,分析PfPI3K通路在青蒿素抗性产生过程中的具体机制。本实验室前期通过三年的药物压力筛选成功培育出六对青蒿素抗性虫株,并选择其中两对虫株进行了转录谱测序分析,通过分析共同差异表达基因发现了编码恶性疟原虫脂酰辅酶A合成酶-1a(PF3D7_1479000,PfACS1a)的基因在青蒿素抗性虫株中低表达,提示该基因与青蒿素抗性相关。本研究在此基础上,通过对该基因进行功能抑制和过表达来探索其对虫体青蒿素敏感性的影响,随后对其所在的通路和相关的分子作用机制进行深入探索,最终旨在阐明PfACS1a在恶性疟原虫青蒿素抗性产生过程中的具体功能。本研究取得的结果如下:1、青蒿素抗性虫株PfACS1a基因的表达下调本研究中所用到的6对青蒿素抗性虫株为本实验室前期采用持续性提高药物浓度的方法体外培育获得的抗性虫株。6对虫株分别为F0827/F0827ART、F0867/F0867ART、F09P-1/F09P-1ART、F0871/F0871ART、F0870/F0870ART、F0758/F0758ART,且经过real-time PCR检测确定PfACS1a在抗性虫株中表达下调。我们知道K13的突变使恶性疟原虫青蒿素抗性升高,那么该抗性是否引起PfACS1a表达量的变化?我们使用pARL质粒分别构建了带有F446I、I543T、C580Y突变位点的K13基因重组质粒,并分别命名为pARL-PfK13~(F446I mut)、pARL-PfK13~(I543T mut)、pARL-PfK13~(C580Y mut)。随后将这些重组质粒分别电转染至K13基因未突变的野生型虫株中,包括3D7~(wt)、FCC1/HN~(wt)、F0829~(wt),以构建带有不同突变位点的K13基因突变虫株。通过单交换我们成功获得了3D7~(F446I mut)、3D7~(I543T mut)、3D7~(C580Y mut)、FCC1/HN~(F446I mut)、FCC1/HN~(C580Y mut)和F0829~(C580Y mut)基因突变虫株。收集基因突变虫株及其亲本虫株的新鲜入侵红细胞6h的环状体RNA,反转录后通过qPCR的方法检测PfACS1a表达量发现K13基因突变的虫株PfACS1a的表达量相较于亲本株均显著下调,初步证实PfK13基因突变可导致PfACS1a在虫体中表达下调。为了进一步验证该结论,我们挑选了29份采集于缅甸拉咱地区的虫株,其中12份是K13基因野生型,17份是K13基因突变型,qPCR检测6h环状体PfACS1a的表达量显示:K13基因突变虫株群体PfACS1a的表达量显著低于K13基因野生型虫株群体(***,p0.001)。上述实验结果证明:K13基因的突变使虫体PfACS1a的表达量显著降低。2、PI3K及其通路调控PfACS1a基因的表达以往研究表明哺乳动物细胞中PI3K-AKT-FOXO为经典的信号通路,而在其他物种的相关报道中FOXO蛋白作为转录因子能够调控脂肪酸的代谢。我们提出假设:是否在恶性疟原虫中存在类似的信号通路,使PfACS1a的表达受到PfPI3K的调控。将PfPI3K的特异性抑制剂LY294002(50mM)和DHA(10nM)分别作用于环状体时期的虫体3h,而后收集虫体并抽提RNA检测PfACS1a的表达量。通过对12株虫株在10nM DHA作用下PfACS1a的表达量检测发现:其表达水平相较于不加药的对照组均有显著升高。随后,检测了其中4株虫株3D7~(wt)、3D7~(C580Y mut)、3D7~(I543T mut)、FCC1/HN ~(wt)加入PfPI3K特异性抑制剂LY294002作用3h后PfACS1a的表达量发现相较于不加药对照组显著的升高(*,P≤0.05;**,P≤0.01;***,P≤0.001)。据此推知:在恶性疟原虫中,PfACS1a可能受到PI3K及其所在通路的调控。3、PfACS1a的表达水平及其活性影响虫体对DHA的敏感性PfACS1a低表达能够降低虫株对DHA的敏感性:通过上述实验我们初步证实了PfACS1a的表达水平与恶性疟原虫青蒿素抗性程度之间存在关联。在此基础上,我们分析了虫株3D7~(wt)和3D7~(C580Y) ~(mut)的PfACS1a表达水平与其青蒿素的敏感性之间的关系。结果显示:虫株3D7~(wt)的PfACS1a表达水平是K13基因突变的3D7~(C580Y) ~(mut)虫株的3倍,差异显著(***,P≤0.001),而其在10nM DHA的作用下生存率为27.01%±0.30%显著低于3D7~(C580Y) ~(mut)虫株的43.58%±1.76%(*,P≤0.05)。同时,在我们筛选出的青蒿素抗性虫株F0871和F0871-ART中检测到F0871的PfACS1a的表达量是青蒿素抗性虫株F0871ART的2倍,差异显著(***,P≤0.001),而F0871ART在10nM DHA作用下的生存率31.95%±2.55%显著高于F0871的23.78%±1.72%(*,P≤0.05)。因此我们证实:PfACS1a表达量下调能够降低虫株对DHA的敏感性。抑制PfACS1a的活性降低虫株对DHA的敏感性:由于在恶性疟原虫中ACS具有多个基因序列和蛋白结构域高度相似的成员,因此采用基因敲除方法来验证PfACS1a功能的思路可能不适合本研究。我们选择了ACS特异性抑制剂三氮菌素C(TriacsinC)进行PfACS1a功能敲低。初步研究表明:TriacsinC在不影响虫体正常生长的浓度下与DHA共同作用于虫体3h可显著降低DHA对虫体的杀伤作用,提高虫体的生存率。我们后续选择了3个K13基因野生型虫株,即3D7~(wt)、F08B-4和F08B-9验证我们的结论。结果显示:DHA单独作用于3D7~(wt)、F08B-4和F08B-9其生存率分别17.76%±1.62%、33.58%±0.42%和29.12%±1.58%,而4mM TriacsinC可显著降低10nM DHA对虫体的杀灭作用,使3D7~(wt)、F08B-4和F08B-9的生存率升高至27.15%±0.15%、39.13%±1.05%和37.9%±0.47%,差异显著(*,P≤0.05,**,P≤0.01)。因此抑制ACS活性可降低恶性疟原虫对DHA的敏感性。过表达PfACS1a升高虫株对DHA的敏感性:我们通过过表达PfACS1a来反向验证PfACS1a的表达量与青蒿素抗性相关。将PfACS1a的基因序列经密码子优化后连接到pLN质粒上,构建过表达质粒pLN-PfACS1a~(mut)。随后通过电转染将过表达质粒pLN-PfACS1a~(mut)和pLN空质粒分别转入虫株3D7~(C580Y) ~(mut)和F0871ART中,将PfACS1a过表达虫株命名为3D7~(C580Y) ~(mut)-PfACS1a和F0871ART-PfACS1a。采用间接免疫荧光实验证明pLN-PfACS1a~(mut)质粒在虫体3D7~(C580Y) ~(mut)和F0871ART中成功表达。收集转染质粒后48h的环状体RNA并检测PfACS1a的表达情况,发现PfACS1a在虫株3D7~(C580Y) ~(mut-)PfACS1a和F0871ART-PfACS1a中表达量显著升高,较亲本虫株3D7~(C580Y) ~(mut)和F0871ART表达上调将近6000倍(***P≤0.001)。检测虫株3D7~(C580Y mut-)PfACS1a和F0871ART-PfACS1a生存率发现:3D7~(C580Y) ~(mut-)PfACS1a的生存率25.04%±2.08%显著低于(***,P≤0.001)3D7~(C580Y) ~(mut)的72.90%±2.72%和3D7~(C580Y) ~(mut)-pLN的61.63%±5.50%,同时也显著低于原始虫株3D7~(wt)的38.58%±1.59%(*,P≤0.05)。在F0871ART虫株中也验证得到类似结果,即虫株F0871ART-PfACS1a在10nM DHA作用下的生存率64.37%±1.46%显著低于F0871ART(83.33%±0.67%)和F0871ART-pLN(68.18%±5.75%)(**,P≤0.01),但与原始株F0871(62.99%±2.11%)差异不显著,说明PfACS1a的过表达使青蒿素抗性虫株F0871ART对青蒿素的敏感性恢复到与亲本株F0871相同。该结果证明,PfACS1a的表达量升高可提高虫株对DHA的敏感性。4、PfACS1a通过活性氧生成、线粒体膜电势去极化和虫体DNA断裂影响虫体生存PfACS1a的表达水平和活性影响虫株在DHA作用下ROS生成量:荧光探针DCFH-DA的荧光强度代表虫体ROS的生成量,荧光强度越高,ROS的生成量越高。对相同原虫率、红细胞压积的虫株3D7~(wt)/3D7~(C580Ymut)、F0870/F0870ART在10nM DHA作用下ROS的生成量检测发现,虫株3D7~(C580Ymut) ROS的生成量19050.64±24.96显著低于3D7~(wt)19555.5±66.5(*,P≤0.05),同样地,F0870ART ROS的生成量27284.75±270.27也显著低于F0870的生成量28118.67±297.32(*,P≤0.05)。以上研究结果证实:下调PfACS1a的表达导致DHA作用下ROS的生成量降低。同时通过10nM DHA作用下虫体的生存率的检测发现3D7~(C580Ymut)的生存率是3D7~(wt)的1.61倍(*,P≤0.05),F0870ART的生存率是F0870的1.67倍(***,P≤0.001)。而对过表达虫株3D7~(C580Ymut)-PfACS1a和F0871ART-PfACS1a在DHA作用下ROS的生成量检测结果显示PfACS1a过表达使虫株在DHA作用下ROS的生成量显著升高(***,P≤0.001)。以上研究证实:PfACS1a的表达水平通过影响虫体在DHA作用下ROS的生成量进而影响虫体对DHA的敏感性。那么PfACS1a的活性对虫体ROS的生成量是否产生影响?我们通过预实验初步得出TriacsinC能够显著降低DHA作用下虫体ROS的生成量,但随着DHA浓度的升高,这种能力逐渐减弱。根据上述结果,我们后续选择了3D7~(wt)、F0829、F08B-4三个K13基因野生型虫株进行验证,结果显示三个虫株在4mM TriacsinC和10nM DHA共同作用下ROS的生成量分别为9564.33±272.36、10901.00±174.74和37564.67±101.67显著低于DHA单独作用虫体ROS的生成量11489.00±78.62、13038.67±51.07和39145.33±393.42(*,P≤0.05,***,P≤0.001)。以上研究证实:抑制PfACS的活性能够减少DHA作用于虫体时ROS的生成量,从而导致虫体对青蒿素的敏感性降低。综上我们得出结论:PfACS1a的表达水平和活性影响虫株在DHA作用下ROS生成量。PfACS1a的表达水平和活性影响虫体线粒体膜电势去极化:根据上述研究我们推测PfACS1a通过影响ROS的生成进而影响虫体的凋亡过程。荧光探针TMRE的荧光强度代表线粒体膜电势去极化的程度,荧光强度越低,虫体线粒体膜电势去极化程度越高。预实验实验结果显示:10nM DHA能够使虫体的线粒体膜电势去极化程度显著升高(***,P≤0.001)。我们选择PfACS1a表达水平显著下调的3D7~(C580Ymut)和F0871ART检测其在相同原虫率和红细胞压积条件下,10nM DHA作用虫体后线粒体膜电势的去极化水平。结果显示:下调PfACS1a的表达可显著降低虫体在DHA作用下线粒体膜电势的去极化程度(*,P≤0.05,**,P≤0.01)。而后我们分别将虫株3D7~(wt)、3D7~(C580Ymut)、F0871和F0871ART的PfACS1a的活性用4mM TriacsinC进行抑制再检测虫株在10nM DHA作用下线粒体膜电势去极化的程度。结果显示:PfACS1a的活性受到抑制能够显著降低DHA造成的虫体线粒体膜电势去极化的程度(*,P≤0.05,***,P≤0.001)。综上所述:PfACS1a的表达水平和活性影响虫体在DHA作用下线粒体膜电势去极化的程度。DHA使虫体凋亡相关蛋白表达水平升高:线粒体膜电势的去极化是凋亡的早期标志。为验证虫体是否发生凋亡,我们对DHA作用虫体后的caspase类似蛋白MCA1和MCA2表达水平进行qPCR检测。结果表明:10nM DHA作用虫株3D7~(wt)、3D7~(I543Tmut)和3D7~(C580Ymut) 3h后MCA1上调了2.25、1.4和2.2倍,3D7~(wt)和3D7~(C580Ymut)的MCA2的表达量分别上调了1.2和2.0倍,其中3D7~(I543Tmut)虫株的MCA2差异不显著,其他均有显著差异(*,P≤0.05,**,P≤0.01)。而这些凋亡相关蛋白过表达后是否发挥了功能?我们选择多种caspase功能抑制剂——Z-VAD-FMK,并将其与10nM DHA共同作用于虫体3h后检测虫体的生存率。研究结果显示:Z-VAD-FMK可显著提高DHA作用下虫体的生存率(**,P≤0.01,***,P≤0.001)。综上证明:DHA作用于虫体上调虫体凋亡相关蛋白的表达,进而影响虫体对DHA的敏感性。抑制PfACS1a活性显著减少DHA引起的虫体DNA的断裂:为进一步证实PfACS1a影响虫体凋亡过程,我们采用TUNEL检测试剂盒对DHA作用下虫体DNA的断裂情况进行了检测。通过预实验的条件摸索我们确定了20nM DHA能够使虫体的DNA断裂比例显著高于对照组(***,P≤0.001)。而使用4mM TriacsinC抑制剂与20nM DHA同时作用于虫体使DNA的断裂比例从DHA单独作用虫体的11.13%±0.88%降低到6.53%±0.19%,具有显著的统计学差异(*,P≤0.05)。以上实验结果证实:DHA能作用于虫体导致其DNA断裂死亡,而抑制PfACS1a的活性能够降低DHA造成的虫体DNA的断裂程度。小结:本课题前期工作已培育了恶性疟原虫青蒿素抗性虫株,通过转录谱的分析初步表明了青蒿素抗性虫株的PfACS1a基因表达下调。在此基础上,本研究采用转基因技术,构建带有F446I、I543T、C580Y的K13基因突变的青蒿素抗性虫株,并证实这些抗性虫株的PfACS1a基因表达下调。此外,K13基因突变的地理株,其PfACS1a表达显著低于无突变的野生株,这些结果表明,PfACS1a基因表达水平与青蒿素抗性相关联。本研究初步阐明了恶性疟原虫青蒿素抗性的相关机制:PfK13的基因突变导致其与PfPI3K的结合减少,从而使PfPI3K泛素化降低降解减少,使PfPI3K在虫体中积聚,通过一定的调控通路导致PfACS1a表达下调。PfACS1a表达量下调和活性被抑制可使虫体在DHA作用下生成的ROS减少,进而使虫体的线粒体膜电势去极化的程度降低。虫体在DHA压力作用下caspase相似蛋白表达量升高并激活,使虫体DNA断裂导致虫体死亡,而抑制PfACS1a的活性则可显著降低DNA断裂的比例,从而使虫体的生存率提高。本研究首次证实PfACS1a可能是恶性疟原虫产生青蒿素抗性的关键抗性分子,全面深入阐明PfACS1a在青蒿素抗性分子机制中的具体功能,将为疟疾防治提供新的研究思路和药物靶点。
【图文】：

发病率,死亡率,全球,疟疾

疟疾是由疟原虫感染引起的以周期性规律发作，全身发冷、发热、多汗，作后，引起贫血和脾肿大为主要特征的寄生虫病。疟疾的病原体主要包括（Plasmodium falciparum）、间日疟原虫（Plasmodium vivax）、三日疟lasmodium malariae）和卵形疟原虫（Plasmodium ovale）[1]。从2000年至2的发病率和死亡率均显著降低。据世界卫生组织统计：2000年全球范围内人口是2.62亿，，死亡人口约84万，而2015年发病人口是2.14亿，死亡人口约期间发病人口降低了37%，死亡人口降低了60%（图1）。而这些疟疾的发88%的病例来自非洲地区，10%来自东南亚地区，2%来自地中海东部地区口中有90%的病例来自非洲地区，7%来自东南亚，2%来自地中海东部地起的5岁以下儿童死亡数量从2000年的72.3万人减少到2015年的30.6万人[2]显示虽然疟疾在全球范围内得到了广泛的控制，但目前世界范围内居住在区的人口仍有33亿之多[3]。疟疾这一古老的寄生虫病依然严重威胁着人类康，其中对人类危害最大的、致死性的是能够引起脑型疟和重度贫血的恶

虫株,地理位置

显示柬埔寨、缅甸、泰国、越南、老挝地区均出现了青蒿素抗性虫株[8-10]（图2）。历史上大湄公河流域也是众多传统抗疟药物最先出现抗性的地区，随后抗性虫株传播进入非洲、拉丁美洲等地区，给人类生命健康和世界经济造成了巨大的损失，使全球疟疾的发病率和死亡率均升高[12-17]。这样的传播速度不禁使我们担忧一旦抗性虫株传入非洲地区那将会造成巨大的灾难。但是由于虫体清除时间的检测方法受到诸多因素的制约，使我们无法及时检测所有感染病例。科研人员发明了一种体外环状体生存实验（RSA0-3h）：即通过将0-3h的恶性疟原虫环状体暴露于700nM浓度的DHA下作用6h，6h后洗去药物并继续培养66h后进行原虫率计数，通过和未加药对照组原虫率进行比较以判定虫株是否出现抗性[18]。该方法能够既简便又有效地于体外检测虫株在青蒿素药物压力下的生存率，使研究人员能够很方便地进行体外大量检测，并判定虫株是否产生青?
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R382.31

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