融合蛋白ΔA146Ply-SP0148经黏膜途径免疫对小鼠肺炎链球菌感染的保护效应研究

发布时间：2020-03-21 08:15

【摘要】：目的:对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)ΔA146Ply、SP0148及ΔA146Ply-SP0148进行克隆、表达及纯化,将纯化后的重组蛋白经鼻腔黏膜免疫C57BL/6小鼠,进一步探讨3种重组蛋白对D39型肺炎链球菌致死性感染的小鼠的保护效果,及其对19F型肺炎链球菌在小鼠鼻咽部及肺部定植的影响。本研究为后续ΔA146Ply-SP0148新型蛋白质疫苗的研发提供实验依据。方法:以PCR技术扩增ΔA146Ply、SP0148基因,通过基因合成技术获得ΔA146Ply-SP0148基因。目的基因连接于pET28a(+)质粒载体,将其转化至BL21感受态细胞中,经IPTG诱导表达及Ni-NTA柱纯化后,拟获得高纯度的ΔA146Ply、SP0148和ΔA146Ply-SP0148三种重组蛋白。将三种重组蛋白作为抗原经鼻腔黏膜免疫C57BL/6小鼠,检测血清中特异性抗体IgG和唾液中特异性抗体IgA的效价。采用D39型肺炎链球菌攻毒免疫小鼠并连续监测小鼠21天的生存率,以评价重组蛋白对C57BL/6小鼠小鼠肺炎链球菌致死性感染的保护效果。最后采用19F型肺炎链球菌经鼻腔滴注小鼠,并计数小鼠鼻腔灌洗液和肺组织匀浆中细菌的载量,以评价ΔA146Ply-SP0148融合蛋白对肺炎链球菌在小鼠鼻腔及肺组织定植的能力。结果:本研究成功构建了ΔA146Ply、sp0148,以及ΔA146Ply-SP0148融合基因的pET28a(+)重组质粒,并最终获得纯度80%的ΔA146Ply、SP0148及ΔA146Ply-SP0148三种重组蛋白。与CT佐剂组比较,△A146Ply组、SP0148组经鼻腔滴注C57BL/6小鼠,其血清中均产生了高效价的IgG和IgA特异性抗体(均P0.01),且△A146Ply-SP0148组更能刺激小鼠产生极高效价的IgG和IgA特异性抗体(P0.001)。对小鼠致死性感染保护的效果评价提示,△A146Ply-SP0148融合蛋白对D39型肺炎链球菌经黏膜途径攻毒所致的小鼠致死性感染能够产生很好的免疫保护效应(与阳性对照PPV23组比较,P0.05)。与PPV23阳性对照组比较,△A146Ply-SP0148组的鼻腔灌洗液和肺组织匀浆中载菌量相对增高,但组间比较无明显差异(P0.05)。以上结果提示,△A146Ply-SP0148重组蛋白能够显著降低19F型肺炎链球菌在鼻腔及肺部的定植能力。粘附抑制实验结果证实,△A146Ply、SP0148、△A146Ply-SP0148重组蛋白刺激小鼠产生的特异性抗血清能明显抑制D39型S.pn粘附到A549细胞表面(均P0.01)。抗体补体杀菌实验证实,△A146Ply、SP0148、△A146Ply-SP0148刺激小鼠产生的特异性抗血清,其激活补体对S.pn的杀灭能力明显高于Anti-CT组(均P0.01)。结论:△A146Ply-SP0148融合蛋白能够诱导小鼠对致死性肺炎链球菌感染的黏膜免疫应答,且能够显著降低19F型肺炎链球菌在小鼠鼻咽部及肺部的定植。由于△A146Ply和SP0148均能诱发Th1和Th17型细胞免疫反应,提示△A146Ply-SP0148融合蛋白有望作为肺炎链球菌新的蛋白质候选疫苗。
【图文】：

图 1 目的基因凝胶电泳图Fig 1 Gel electrophoresis of target gene注：图 1 A M: DNA Marker 2000 ; 1 泳道: △A146Ply 基因扩增产物; 图 1B M: DNA Marker 2000 ; 1-: sp0148 基因扩增产物; 图 1C M: DNAMarker 5000 ; 1-2 泳道:△A146Ply-sp148 基因合成产物.对 构 建 成 功 的 pET-28a(+)-△A146Ply 、 pET-28a(+)-sp0148 和 pET-28A146Ply-sp0148 重组质粒进行双酶切鉴定，，酶切产物采用 1.5%琼脂糖凝胶电泳见与目的基因大小相符的酶切片段(结果见图 2) 。上述质粒均送上海生工生物技司进行测序，测序结果证实其与预期相符，提示 3 种重组质粒均构建成功(见图

可见与目的基因大小相符的酶切片段(结果见图 2) 。上述质粒均送上海生工生物技术公司进行测序，测序结果证实其与预期相符，提示 3 种重组质粒均构建成功(见图 3）图2 重组质粒双酶切鉴定Fig. 2 The double enzyme digestion of recombinant plasmids.注: 图2 A M: DNA Marker 5000; 1 泳道: pET-28a(+)-△A146Ply重组质粒双酶切产物; 2 完整pET-28a(+)-△A146Ply重组质粒。图2B M: DNA Marker 5000; 1 泳道: pET-28a(+)-sp0148重组质粒双酶切产物; 2 泳道: 完整pET-28a(+)-sp0148重组质粒。图2C M: DNA Marker 5000; 1 泳道: pET-28a(+)-△A146Ply-sp0148重组质粒双酶切产物; 2 泳道: 完整pET-28a(+)-△A146Ply-sp0148重组质粒。
【学位授予单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392

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本文编号：2593048