构建中性粒细胞自发凋亡过程lncRNA-miRNA-mRNA内源竞争性RNA网络筛选中性粒细胞自发凋亡过程中关键的lnc

发布时间：2020-03-21 06:12

【摘要】：目的:多形核嗜中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)又称中性粒细胞,是人体血液循环中数量最多的一类白细胞,是防御细菌和真菌感染的第一道防线,在人体非特异性免疫反应中起着非常重要的作用。中性粒细胞是终末分化细胞,生命期限极短,仅24~48小时,并拥有能高效杀死病原体的强大毒性武器,但它们同样能造成正常组织的损伤。因此,中性粒细胞的死亡必须被精确调控,这一任务主要是通过中性粒细胞自发程序性凋亡完成,且在免疫系统稳态和炎症消退中起重要作用。近年人们发现长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在各种重要的生物学过程中发挥调控作用,拥有较长核酸链的非编码RNA(lncRNA)可以通过结合特定序列的miRNA来调控编码蛋白的mRNA表达,因此lncRNA被称为miRNA海绵。越来越多的证据表明,lncRNA作为竞争性内源性RNA(competitive endogenous RNAs,ceRNAs)可能与中性粒细胞凋亡密切相关。但其具体调控机制目前仍不十分清楚。本研究通过检测中性粒细胞自发性凋亡过程中miRNA、lncRNA、mRNA的差异表达,使用生物信息学的方法构建lncRNA-miRNA-mRNA内源竞争性RNA网络,并分析获得中性粒细胞自发性凋亡过程中的关键lncRNA。方法:(1)分离健康志愿者中性粒细胞,进行中性粒细胞(0小时,12小时,24小时)自发凋亡实验;(2)分别抽提各时间点中性粒细胞的RNA;(3)运用miRNA芯片技术检测并筛选出差异表达的miRNA;(4)从筛选出的差异表达的miRNA中选取4个(hsa-miR-487b、hsa-miR-4538、hsa-miR-4417和hsa-miR-4485)进行RT-PCR检测,验证芯片结果的可靠性;(5)检索GEO,从GEO下载中性粒细胞mRNA和lncRNA时间序列的转录数据并筛选出差异表达的lncRNA和mRNA;(6)使用miRWalk、miranda和Targetscan预测差异表达miRNA的靶mRNA,使用miRWalk、RNAhybrid和Targetscan预测差异表达miRNA的靶lncRNA。(7)将差异表达lncRNA和差异表达mRNA分别与差异表达miRNA的靶lncRNA和mRNA合并取交集。得到miRNA-mRNA基因对库和miRNA-lncRNA基因对库。(8)利用cytoscape软件将miRNA-mRNA基因对和miRNA-lncRNA基因对,映射到互作网络中,最终构建lncRNA miRNA mRNA ceRNA互作网络。(9)分析lncRNA miRNA mRNA互作网络,筛选自发性凋亡过程中的关键lncRNA,并用RT-PCR验证。结果:(1)miRNA芯片结果:以0小时组中性粒细胞为对照,选择表达倍数2为上调,表达倍数0.5的为下调,miRNA芯片数据表明中性粒细胞自发性凋亡过程中一共有81个差异表达miRNA,其中上调表达的有49个,下调表达的有32个;在12小时组表达上调和下调的miRNA均有21个,24小时组表达上调和下调的miRNA分别有41个和22个。RT-PCR检测上调表达的hsa-miR-487b和hsa-miR-4538的和下调表达的hsa-miR-4417和hsa-miR-4485,结果与芯片结果一致。(2)GSE37416 mRNA-lncRNA芯片数据挖掘结果:以0 h组为对照,采用LIMMA分析,p值0.01和表达倍数2倍,筛选出中性粒细胞自发性凋亡过程中有176个差异表达lncRNA和1966个差异表达mRNA。(3)构建lncRNA-miRNA-mRNA网络,用Cytoscape对其进行可视化,该网络由117个lncRNA节点、671个mRNA节点、59个miRNA节点和3636条边组成。(4)使用DAVID和BinGO分析ceRNA网络中所有差异表达mRNA,高富集GO包括:I-kB激酶/NF-kB级联的调控、细胞内信号级联和正向调控程序性细胞死亡等。KEGG通路分析显示,8个通路明显富集其中包括凋亡、toll样受体信号通路和趋化因子信号通路等。(5)对lncRNA-miRNA-mRNA网络进行拓扑机构分析,并构建关键子网络,筛选出3个以lncRNA(AC021016.2,LINC00909,TTN-AS1)为关键核心的子网络,RT-PCR检测3个lncRNA表达结果与芯片结果基本一致。结论:(1)获得并分析了中性粒细胞自发性凋亡过程中的mRNA、lncRNA和miRNA差异表达谱。(2)基于ceRNA理论,首次构建了一个中性粒细胞自发凋亡过程mRNA-miRNA-lncRNA内源竞争性RNA网络。(3)在mRNA-miRNA-lncRNA内源竞争性RNA网络中,筛选出3个以lncRNA为核心的子网络,3个lncRNA(AC021016.2,LINC00909,TTN-AS1)可能通过调节miRNA的表达参与调节中性粒细胞自发性凋亡。本研究首次描绘了中性粒细胞凋亡过程中内源竞争性RNA调控网络,也筛选获得了3个关键调控lncRNA,将为后续进行中性粒细胞自发性凋亡机制的研究提供新思路。
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392.12

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本文编号：2592904