人外周血单个核细胞建立诱导性多能干细胞（iPSCs）及永生化细胞的方法探究

发布时间：2020-03-20 20:11

【摘要】：诱导性多能干细胞于2006年在日本首次成功建立,是一种将高度分化的成熟体细胞通过诱导使其基因重编程的技术。最终细胞回归到类似于胚胎干细胞拥有能够自我更新复制以及强大分化潜能的多能干性的细胞状态。诱导性多能干细胞的应用前景十分广泛,可应用于疾病模型、再生医学及药物研发等领域。伴随着发展,诱导性多能干细胞在技术上也正在不断进步和突破,从最初的整合基因法到相对安全可靠的非整合基因法,从依赖滋养层细胞的培养方法到完全排除外源细胞干扰的无滋养层细胞培养方法,诱导性多能干细胞技术逐渐趋向简单化、程序化。海弗利克极限理论指出了细胞的分裂次数是有限的,但在一些特殊条件的刺激下,细胞能够逃脱此极限,从而达到永生化的状态。永生化的细胞是一种处于正常细胞与癌细胞之间的形态,细胞能够无限增殖,并且没有恶化的表征。对永生化细胞的深入研究可帮助我们了解正常细胞与肿瘤细胞之间生理及功能的变化,以及有助于探究细胞衰老的生理机制。永生化细胞也可作为一种人类遗传资源进行收集,尤其是某些疾病特性基因,以活细胞的形式储存起来,建立永生化细胞库。本研究采用人外周血单个核细胞作为细胞来源,采样便捷、安全,对人体的损伤小。以仙台病毒作为载体,将承载着的4种胚胎干细胞特异表达的关键细胞因子,导入来源细胞中使其重编程,以此构建诱导性多能干细胞系。在原代及传代的培养中摒弃传统的含外源细胞的滋养层培养方法,以无滋养层细胞培养的方法取代。同时,在来源细胞中提取微量的细胞,建永生化B淋巴细胞系。技术优化后所建立的细胞系在经过了培养、传代及鉴定,最终实验结果显示:1、培养至第12天出现明显的细胞克隆团,第18天成为典型的诱导性多能干细胞,诱导性多能干细胞间细胞间紧密接触、无明显间距,克隆团的边缘清晰,形态与胚胎干细胞相似;2、细胞AP染色结果呈阳性,表明细胞重编程并回归未分化的干细胞状态;3、免疫荧光检测诱导性多能干细胞表面抗原Oct4与SSEA4呈阳性;4、诱导性多能干细胞三胚层分化鉴定成功,证明了细胞的分化潜能;5、永生化B淋巴细胞以聚团的形态生长,流式检测CD19阳性细胞占总细胞的89.92%。诱导性多能干细胞与永生化B淋巴细胞建系方法的结合,充分利用了来源的细胞资源。永生化B淋巴细胞的收集,尤其是一些罕见的基因疾病细胞,可为日后细胞生理机制等科研探索提供遗传资源的储备。诱导性多能干细胞存在未来存在医学应用可能性,可填补永生化B淋巴细胞因细胞非正常而无法应用于临床的缺点。本文对技术细节的优化提高了效率,节省了时间成本,操作步骤的简化使未来细胞培养全自动化的可能性更进一步。
【图文】：

多能干细胞,诱导性

in day 1. B: Growth of iPSCs in day 2. D: Growth of iPSCs me differentiated cells occurred in the culture process. Scale =性多能干细胞的 AP 染色鉴定同一视野下诱导性多能干细胞在 AP 染色结果，碱一种单酯磷酸水解酶，在具有全能干性的胚胎干细化后，AP 表达及活性便随之降低（图 2-3-D）。本酸酶呈阳性（图-2-3-A 和 B），表明本实验的诱导在未分化的干性细胞状态。空白对照组为不加指示），，阴性对照组采用成纤维细胞，由于纤维细胞为分-3-D）。由人外周血单个核细胞建立的诱导性多能干经过重编程回归到与胚胎干细胞相似的多能干细胞证实了这一过程。

多能干细胞,诱导性,荧光染色,合并图

图2-4-B 和 D 显示的蓝色是细胞核，图 2-4-C 和 F 是完整的合并图。空白对照是不加Oct4 与 SSEA4 抗体而直接进行二抗染色的 iPSCs。阴性对照组是成纤维细胞，由于细胞已分化，细胞不存在 Oct4 与 SSEA4 的表面抗原。空白对照组与阴性对照组均不显色。免疫荧光鉴定结果表明诱导性多能干细胞表达了细胞因子Oct4与SSEA4。图 2-4 诱导性多能干细胞的荧光染色鉴定Figure 2-4 Fluorescence image of iPSCsA: Oct4 抗原显色结果；B: 细胞核 DAPI 显色结果；C: A 与 B 结果合并图；D: SSEA4 显色结果；E:细胞核 DAPI 显色结果；F: D 与 E 结果合并图。比例尺=200 μm。A: Fluorescence image of Oct4+ cells. B: DAPI for the nuclear. C: The combined diagram of A and B.
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R329.2

【参考文献】