低氧对新生隐球菌转录组的影响和隐球菌漆酶的表达纯化

发布时间：2020-03-21 16:43

【摘要】：背景和目的新生隐球菌(C.neoformans)是一种重要的导致系统感染条件致病真菌,在环境中广泛存在,主要侵犯器官移植、AIDS、细胞毒药物化疗等长期应用等造成的免疫缺陷患者,此外也可感染免疫功能正常人,主要引起致命性的脑膜脑炎,感染死亡率非常高,而且这种感染容易造成慢性化或潜伏感染状态。新生隐球菌主要的致病因素为产黑素、荚膜、外分泌酶的毒性作用及其在宿主体温环境下生长的能力等。C.neoformans是专性需氧的致病酵母菌,在实验室条件下,新生隐球菌在大气氧浓度(21%)条件下生长最佳。吸入C.neoformans后可通过血液播散到达中枢神经系统导致致命性的脑膜脑炎。众所周知,人脑组织的氧浓度明显低于大气氧含量(21%),并且不同的解剖部位也不同。此外,炎症、血栓形成以及感染相关的坏死也导致组织氧含量下降。因此,Cneoformans在致病过程中必须面对并适应宿主组织氧含量的变化。国内外最新研究认为C.neoformans这种专性需氧致病酵母菌可以适应缺氧环境并生存,并且在中枢神经系统的生长在于调整其复制速率以适应相应的氧含量的变化,并描述了C.neoforman 两种可能感应缺氧的途径,即SREBP(甾醇调节因子连接蛋白家族)和Tco1途径,但缺氧适应对C.neoformans毒性因子的影响尚未被关注。我们前期研究中新生隐球菌在低氧条件下其毒力因子荚膜、黑素、磷脂酶尿素酶等表型较正常氧条件下变化明显,但其具体机制并不清楚,并且低氧对新生隐球菌慢性潜伏感染的影响机制尚不清楚。黑素是新生隐球菌重要的致病因素之一,黑素不仅可保护隐球菌免受外界破坏,而且是重要的致病因子,并且还具有调节免疫功能。新生隐球菌通过漆酶将L-DOPA转换成了多巴醌,添加氨基后形成了环多巴。氧化的环多巴转换成了多巴色素,多巴色素互变异构后形成了二羟吲哚,最后其自由聚合后形成了黑色素(带负电荷的色素)。新生隐球菌漆酶有两种基因编码:LAC1和LAC2。Lac1是黑色素合成的重要作用酶。因此对漆酶的研究至关重要。但是,由于天然本体菌株产生的漆酶量少,不易纯化等,因此,建立大量重组表达纯化并且具有活性的漆酶异源表达系统至关重要。近年来,越来越多的不同来源的漆酶基因被克隆,并在不同宿主中异源表达,但是大部分属于植物真菌,而对人类致病的重要病原真菌的漆酶蛋白的异源表达尚未发现相关研究。因此本实验拟建立新生隐球菌漆酶的异源表达系统,为进一步研究漆酶的性质等奠定基础。综上所述,本文的目的是1)探讨低氧对新生隐球菌转录组尤其是重要毒力因子黑素、荚膜等的影响,以期对新生隐球菌慢性潜伏感染的机制研究提供思路;2)在原核、真核及昆虫表达系统中表达新生隐球菌漆酶重组蛋白;3)对新生隐球菌漆酶重组蛋白进行纯化及活性研究,为后续漆酶晶体结构研究奠定基础。方法1)低氧和正常氧条件下培养新生隐球菌,进行RNA-Seq测序分析,研究低氧对隐球菌菌株转录组的影响。2)利用全基因合成并优化密码子合成新生隐球菌漆酶基因,构建到大肠杆菌、毕赤酵母表达菌株以及昆虫细胞sf9细胞,并通过尝试不同温度、IPTG诱导浓度以及培养时间等探讨新生隐球菌漆酶在原核、真核和昆虫系统中的表达情况。3)根据上述表达情况,探讨不同组合方法对新生隐球菌漆酶重组蛋白进行纯化并检测其活性。结果1)低氧条件下有316个基因表达存在差异,其中212个基因表达上调,104个基因表达下调。常氧培养组,与Oh相比,有519个基因表达发生变化,其中368个基因表达上调,151个基因表达下调。Cap59、Caap10、Cap64、Lac1和Ura5基因在两种培养条件下,各个时间点的表达均无差异。其他新生隐球菌毒力相关新基因表达也发生了不同变化。2)新生隐球菌漆酶重组蛋白可在原核细胞大肠杆菌中成功表达,在37℃和16℃条件下,O.1mM、0.5mM、ImMIPTG浓度诱导下,大部分以包涵体形式表达。而在真核系统毕赤酵母中,未能成功表达。在昆虫表达系统中,新生隐球菌漆酶重组蛋白以分泌蛋白形式可溶表达。3)新生隐球菌漆酶重组蛋白包涵体表达可以通过变复性方法,Q柱、Gel Filtration,Mono Q柱方法纯化得到纯度90%以上的蛋白。在昆虫表达系统表达的重组蛋白,可经过NI-NTA方法进行纯化得到高纯度活性蛋白。结论低氧条件下新生隐球菌转录组发生变化,主要毒力相关基因表达发生变化,不同时间点的变化趋势有所差异。通过优化后全合成新生隐球菌Lac1基因并克隆至大肠杆菌BL21,该原核系统可成功大量表达新生隐球菌漆酶蛋白,并大部分以包涵体形式存在。通过Q柱等方法可纯化新生隐球菌重组漆酶蛋白,纯度可达90%以上。在昆虫表达系统中,新生隐球菌漆酶蛋白以可溶形式分泌表达,并经过NI-NTA纯化得到高纯度活性蛋白。综上,新生隐球菌漆酶的外源成功表达与纯化可为后续研究如漆酶晶体结构解析提供基础,可能为新生隐球菌致病机制的研究提供新思路。
【图文】：

多糖荚膜,新生隐球菌

于脲酶所致的氨的生成和／或ｐＨ的升高。在体外，追踪一个暴露于野生型或ｕｒｅｌ突变型真菌逡逑的ＨＢＭＥＣ细胞的紧密连接标记物（ＺＯ－１）发现，突变的真菌解除连接的能力较弱。逡逑２．４多糖荚膜逡逑通过早前的真菌分离研宄，包裹隐球菌的胞外荚膜很早为人们所关注［５２］。但是多年后逡逑才由Ｂｅｎｈａｍ［５３］提出了这个结构在致病中发挥重要作用。从一个从结构和功能很少被关注的逡逑结构，隐球菌荚膜已经是目前最重要且最广为研宄的隐球菌毒力因子。尽管如此，隐球菌荚逡逑膜的合成、结构和功能仍有许多未知之处。研究多糖荚膜最初是通过纸色谱分析法，，确定了逡逑甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸和半乳糖的存在［５４］。之后的研宄还发现多糖荚膜可以通过与兔逡逑子超免疫血清反应进行隐球菌血清分型［５５］。Ｒｅｂｅｒｓ［５６］发现隐球菌荚膜多糖可分为两个部逡逑分。之后，Ｂａｔａｃｈａｉｊｅｅ和同事［５７］发现纯化的荚膜多糖的较大的部分结构并不包含半乳糖。逡逑研究者把这个多糖叫做ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｘｙｌｏｍａｎｎａｎ（ＧＸＭ）。而在１９８２年，Ｃｈｅｍｉａｋ［５８］发表文章首逡逑次描述了较小的那类含半乳糖的荚膜多糖，这部分结构之后被命名为ｇａｌａｃｔｏｘｙｌｏｍａｎｎａｎ逡逑（ＧａｌＸＭ），然后又被重命名为ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｘｙｌｏｍａｎｎｏｇａｌａｃｔａｎ邋（ＧＸＭＧａｌ）。逡逑

氨基酸序列,漆酶,新生隐球菌,细胞定位

这些位点都被证实与来源于ＣＮＬＡＣＩ邋ｃＤＮＡ的氨基酸序列构成的结构域一致。隐球菌漆酶逡逑的分子模型是基于Ｃｏｐｒｉｎｕｓｃｉｎｅｒｅｕｓ漆酶的ｘ线数据构成的，展示了四个铜中心结构域的紧逡逑密结合（图１．３邋ａ，ｂ）。纯化的隐球菌漆酶通过高效液相色谱法和质谱法测定，它可以催化多巴逡逑胺产生一种重要的黑色素中间产物多巴色素。该酶也表现出对儿茶酚胺的高度专一性，这个逡逑可能有助于亲神经性新生隐球菌的漆酶的优化。逡逑（ａ）逦（的逦ｆ逡逑ＣＮＬＡＣＩ逦１１６邋ＬＨＷＨＧ逦Ｗ邋Ｗ邋Ｈ邋Ｓ邋Ｈ邋Ｙ邋１６５逦ｆ逦Ｍ逡逑ＣＮＬＡＣ２逦１１６邋Ｉ邋Ｈ邋Ｋ邋Ｒ邋Ｇ逦ＷＷＨＳＢＹ邋１６５逦＼逦ｖ逦／Ｂ－Ｊ逦＾逡逑Ｎ邋ｃｒａｓｓａ逦９４邋Ｉ邋Ｈ邋Ｎ邋Ｈ邋Ｇ逦ＷＹＨＳＨＦ邋１４３逦／逦）邋Ｊ邋Ｗ邋ＪＦ邋／逡逑Ｃ邋ｈｉｒｓｕｔｕｓ邋６９ＩＨＷＨＧ逦Ｆ邋Ｔ邋Ｈ邋Ｇ邋Ｈ邋Ｌ邋１１８逦，、逦Ｉ逦ＪＭ邋ｗ－逡逑ｂｃｐ．．．．．．备逡逑ＣＮＬＡＣＩ逦４８０邋ＨＰＹＨＬＨＧＮＥＦ逦＾Ｍｔｍ＼邋ＪＰ邋＾逡逑ＣＮＩＡＣ２逦４７７邋Ｈ邋Ｐ邋Ｙ邋Ｈ邋Ｉ邋Ｈ邋Ｇ邋Ｎ邋Ｅ邋Ｆ逦ｆ逡逑Ｎ邋ｃｒａｓｓａ邋４２８邋ＨＰＩＨＬＨＧＵＤＦ逦＾邋一ｙ逦ＴｊＭＰ１Ｖ＾ＬＺ，邋ｕ逡逑Ｃ邋ｈｉｒｓｕｔｕｓ邋４１６ＨＰＦＨＬＨＧＨＡＦ逦Ｓ逦＾邋／／逡逑Ｈｅｐ．逦９７９邋ＨＴＶＨＦＨＧＨＳＦ逦＜逦／＾［邋（■邋＼邋＾Ｋ－＇；逡逑…３＊逦ｔＸ逦ｆＡＡｉ逡逑ＣＮＬＡＣＩ逦５４３逦ＨＣＨＩＧＷＨＬＴＥＧ逡逑ＣＮＬＡＣ２逦５４０逦ＨＣＨＩＧＷＨＬＡＫＧ逦７逦＿逡逑Ｎ邋ｃｒａｓｓａ邋４９９邋ＨＣＫＶＡＷＫＶＳＧＧ逦＇邋）ｈ邋；、邋
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R379.5

【参考文献】