新型复合乳佐剂的制备及其在狂犬病疫苗中的运用和机制研究

发布时间：2020-03-21 22:18

【摘要】：狂犬病是由狂犬病毒感染引起的全球范围内广泛流行的人兽共患病,患者发病后病死率接近于100%。狂犬病毒感染后先在局部肌肉组织中复制和扩散,然后迅速沿末梢神经和神经周围间歇的体液上行进入中枢神经系统,上行过程中病毒在神经节细胞中大量复制。由于中枢神经系统被内皮细胞紧密包裹,中和抗体,补体蛋白等特异性免疫应答成分难以进入其中发挥作用,而且其中缺乏巨噬细胞,炎性因子等非特异性免疫应答成分。因此,一旦病毒进入中枢神经,即便机体产生了高滴度的中和抗体也不能为机体提供有效保护。目前广泛使用的无佐剂狂犬病疫苗往往要到14 DPI(day post inoculation)才能达到100%的阳转率,而在上世纪使用的铝佐剂狂犬病疫苗要到42 DPI才能达到100%的阳转率。探索能够激发机体快速或者持久产生特异性和非特异性免疫应答的佐剂对于狂犬病的防控至关重要。本研究将狂犬病疫苗毒株CTN-1-D15接种到人胚肺二倍体细胞中培养制备抗原。然后通过细胞ELISA方法检测抗狂犬病毒抗体以筛选佐剂成分,发现100 μ g/mL紫杉醇在3 DPI抗体滴度0D平均值为0.717,采用方差分析发现:它与其它佐剂成分实验组之间差异显著(p0.01),表明紫杉醇具有快速刺激抗体的能力;MF59在14 DPI使抗体滴度0D平均值为0.945,与无佐剂组(0D平均值为0.493)比较其差异显著(p0.01),说明它能刺激机体高水平中和抗体的产生。鉴于紫杉醇和MF59具有细胞毒性和过敏反应及持久性差的问题,本研究将二者联合以降低它们的使用浓度;另外辅酶Q10能够稳定细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶(SDH)的活性,它不但有利于三羧酸循环代谢而且利于线粒体驱动巨噬细胞产生炎性因子。配制时采用角鲨烯萃取混悬液中的辅酶Q10,再按照体积比(5.0%角鲨烯;0.5%吐温;0.5%司班)混匀后分散在琥珀酸-柠檬酸钠缓冲液中,然后在800psi条件下通过高压均质机使其达到水包油(O/W)的状态,再用0.01 M的PBS稀释1倍后加入20 μg/mL的紫杉醇制备而成,因其制备环节呈金黄色故命名为Golden05。将狂犬病Golden05佐剂疫苗分别在第0,3和7天对ICR小鼠进行肌肉免疫。然后用快速免疫荧光抑制灶试验(RFFIT)监测小鼠血清中和抗体滴度变化趋势,发现实验动物在5 DPI时开始产生有效的中和保护抗体(0.83 IU/mL),当完成三针注射后的28 DPI时,抗体水平达到2.86 IU/mL,连续监测至免疫后第3个月,抗体均能够维持在较高水平(2.05 IU/mL)。并在14 DPI时,使用狂犬病标准攻毒株CVS-11对免疫后小鼠进行挑战试验,结果显示狂犬病Golden05佐剂疫苗的保护效果达到100%。分析其免疫学机制发现Golden05能显著提高体内细胞线粒体的SDH活性,并能够提高机体IFN-γ,TNF等前炎性因子的表达,产生非特异性免疫应答;同时促进CD8+T细胞的大量增殖,从而使浆细胞活化,能快速大量地产生中和抗体,激活特异性免疫应答。并在物理化学和动物安全性评价中,Golden05具有良好的稳定性和安全性。本研究通过维持细胞SDH活性,改良MF59并联合紫杉醇制备的复合乳佐剂能够快速且持久地诱导机体产生抗狂犬病毒特异性和非特异性的保护性免疫应答。
【图文】：

散点图,检测方法,线性关系,活病毒

？邋ｉ一＾一＾４邋一７咖值ｑ邋４．５逦ｆ逦＾逡逑Ｔ３逦４逡逑ｇ邋３．５逡逑Ｍ逦ｚｉ逡逑？逦２５逦逦１逡逑§逦Ｊｎ—逦逦逦逦逦逦逦ＯＤ邋值逡逑ｆ邋0５逡逑韧逦0邋１逦２逦３逦４逦５逡逑四个不同的批次逡逑图１．邋１．四批次病毒原液使用两种方法检测结果的相关性分析逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１．邋Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｆｏｕｒ邋ｂａｔｃｈｅｓ邋ｏｆ邋ｒａｂｉｅｓ邋ｖｉｒｕｓ邋ｂｙ邋ｔｗｏ邋ｍｅｔｈｏｄｓ．逡逑如果将两种检测方法分别与其对应的病毒滴度进行分析，首先将数据转换，绘逡逑制线形相关散点图（图１．邋２）显示其线性回归拟合直线方程为ｙ＝３．邋２２３２ｘ邋－邋０．邋７８５４，逡逑Ｒ２＝０．邋９７９３，同时ｔ检验结果为１．邋７６５，邋ｐ〈０．邋０１，均表明两种对活病毒滴度检测方法逡逑之间的线性关系具有显著的意义。逡逑

检测结果,狂犬病毒,病毒,收毒

培养条件逦条件的梯度设置逡逑接种量逦１％逦２％逦３％逦４％逦５％逡逑胞龄逦２４ｈ逦４８ｈ逦７２ｈ逦９６ｈ逡逑带毒传细胞比例逦１：２逦１：４逦１：８逡逑培养温度邋３３°Ｃ逦３５邋°Ｃ逦３７邋°Ｃ逡逑血清浓度逦２％逦５％逦１０％逡逑基础培养基逦ＭＥＭ逦ＤＭＥＭ逦１６４０逦ＭＥＭ／ＤＭＥＭ逡逑ｐＨ邋值逦６．８逦７．０逦１．２逦７．６逦７．８逡逑换液的体积逦５０％逦６０％逦７０％逦８０％逦９０％逡逑培养时间对狂犬病毒产量的影响：狂犬病毒吸附到敏感细胞需要至少３０邋ｍｉｎ，逡逑病毒复制周期一般１９－２４小时，最快为６小时，所以培养狂犬病毒的时间对于病毒逡逑产量具有影响，连续监测１２，邋２４，，４８，，邋７２和９６小时后病毒收获液的细胞ＥＬＩＳＡ法的逡逑０Ｄ值的变化见图１．邋３。结果发现培养病毒从１２到７２小时，病毒滴度随着培养时间逡逑的延长而增加，到７２小时达到相对峰值，如果继续培养到９６小时，０Ｄ值依然会得逡逑到升高，但是获得的收益和时间成本比较起来，获益有限。所以，狂犬病毒培养时逡逑间为７２小时后收毒适宜。逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392-33

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