脾脏在小鼠肝纤维化进展及修复过程中的作用及机制研究

发布时间：2020-03-21 22:32

【摘要】：【背景】肝纤维化是肝脏对慢性肝损伤因素(如酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、病毒性肝炎等)应答的一种创伤修复反应,是反复持续性肝脏损伤刺激产生的共有病理改变,表现为胞外基质合成与分解平衡紊乱。晚期肝纤维化发展为肝硬化,伴有结构丧失、功能衰竭和危及生命的并发症。近年来临床研究发现,由病毒性肝炎造成肝纤维化或肝硬化的患者,在成功接受病毒性肝炎治疗后,其肝纤维化甚至肝硬化发生了逆转现象。在啮齿类动物肝纤维化模型中的研究发现,移除病原体、中断发病原刺激下的肝纤维化也可以得到逆转。因此,研究和了解肝纤维化逆转的机制有利于发现新的针对肝纤维化的治疗靶向。近年来研究发现,免疫细胞是纤维化中的关键角色,它有对诱导损伤和促进修复施加影响的能力。肝星状细胞(HSC)是参与肝纤维化过程中的最重要细胞,其自身活化和增殖及胶原合成增加是肝纤维化形成的中心环节;在CCl_4和BDL诱发的大鼠肝纤维化模型中,HSC的减少可以显著地减弱肝纤维化以及肝脏损伤。因此,减少活化的HSC数量是逆转肝纤维化的关键所在。前期研究表明,脾脏来源的免疫细胞(巨噬细胞、T细胞)参与肝慢性纤维化病变进程,且在肝硬化病变后期,脾脏亦可以受到影响而发生脾脏肿大及脾功能亢进,提示肝-脾免疫存在复杂相互影响。纤维化进展过程中,脾脏切除可一定程度延缓肝脏纤维化的进程,并影响肝纤维化逆转,提示脾脏切除可能影响肝脏中活化的HSC,进而影响肝脏的纤维化修复过程,但脾脏究竟以何种方式,并如何影响HSC目前尚不清楚。【目的】探讨脾脏在肝纤维化进展及修复过程中对肝纤维化的影响及机制。【方法】1.实验分组健康雄性C57小鼠,清洁级,体重15-20g,由西安交通大学医学部实验动物中心提供。全部动物均在同一实验室按清洁级小鼠要求由专人饲养,自由进食水。将25只小鼠随机分成实验组:切脾+继续打CCl_4组(A组,n=5)、切脾+停止打CCl_4组(B组,n=5)、假手术+继续打CCl_4组(C组,n=5)、假手术+停止打CCl_4组(D组,n=5);对照组:空白对照组(E组,n=5)。各组于造模6周后取材。水合氯醛腹腔注射麻醉,眼球取外周血,无菌条件下切开皮肤进入腹腔,留取左叶肝组织150mg以备提取蛋白及核酸;另外切取部分肝脏左叶,以4%多聚甲醛固定,用于HE染色、天狼猩红染色及免疫组织化学法染色;再切取部分肝脏左叶,OCT包埋并置于液氮中快速冰冻后保存于-80℃冰箱中,用于免疫荧光染色。2.肝纤维化进展及修复过程的小鼠模型建立实验组(A、B、C、D组)给予四氯化碳(CCl_4)油溶液腹腔注射(CCl_4:Corn Oil=1:4),空白对照组(E组)给予溶剂注射,每隔两天注射一次,实验组连续造模4W后A、B组给予脾切除处理,C、D组给予假手术处理。术后A、C组继续注射CCl_4两周,B、D组停止注射CCl_4两周。六周时处死小鼠并取材肝脏标本进行相应检测。3.数据采集及分析HE染色及天狼星红染色法显示肝纤维化程度,qPCR检测纤维化相关基因表达变化,Western Blot检测Ⅰ型胶原及αSMA蛋白表达水平。制备肝脏组织石蜡切片,β半乳糖苷酶染色试剂盒检测肝星状细胞衰老情况;制备肝脏组织冰冻切片,caspase3与Tunel免疫荧光检测肝星状细胞凋亡情况,p53免疫荧光检测肝星状细胞衰老状况。制备肝、脾及血清单细胞悬液,流式细胞仪检测单核巨噬细胞数目变化。转录组测序(RNAseq)检测肝脏相关因子表达变化情况。【结果】1.小鼠肝纤维化造模情况造模6周后,与对照组相比,实验组(A、B、C、D组)可见不同程度的肝细胞坏死并出现肝纤维化。HE染色可见B、C组均出现明显假小叶形成,且C组假小叶出现更多,更为明显,几乎看不到正常的肝脏组织,并伴有大量炎性细胞浸润。与C组相比,A组肝纤维化程度明显减轻;天狼星红染色发现A组较C组纤维条索明显减少;与D组相比,B组肝纤维程度更为严重;qPCR结果显示实验组肝纤维化相关基因,包括αSMA、TGFβ、PDGFβ、TNFα等均出现显著性上升,其中A、C组及B、D组变化趋势与HE及天狼星红染色结果一致。Western Blot检测发现,与C组相比,A组αSMA及Ⅰ型胶原蛋白表达明显下降;与D组相比,B组αSMA及Ⅰ型胶原蛋白表达明显升高,与之前实验结果相符。2.肝星状细胞的变化小鼠肝组织冰冻切片Caspase-3及Tunel分别与Desmin的免疫荧光双标染色结果显示,在造模4周后继续注射CCl_4的A、C组中,切脾组(A组)较假手术组(C组)肝星状细胞Caspase-3与Tunel表达显著升高(p0.01);在造模4周后停止注射CCl_4的B、D组中,切脾组(B组)肝星状细胞Caspase3与Tunel表达较假手术组(D组)显著降低(p0.05);β半乳糖苷酶染色显示,在造模4周后继续注射CCl_4的A、C组中,切脾组(A组)肝星状细胞β半乳糖苷酶表达较假手术组(C组)明显升高;在停止注射CCl_4的B、D组中,切脾组(B组)肝星状细胞β半乳糖苷酶表达较假手术组(D组)明显降低。流式细胞术显示C组较A组肝星状细胞标记物VitaminA~+细胞占肝组织非实质细胞数目的比例显著升高(p0.001),D组较B组VitaminA~+细胞数目显著降低(p0.05)。3.肝纤维化组织中外来巨噬细胞数目变化流式细胞术结果显示,与假手术继续打CCl_4组(C组)相比,切脾继续打CCl_4组(A组)小鼠肝组织中外来巨噬细胞(F4/80~(low)CD11b~(high))数目占非实质细胞数目的比例显著降低(p0.05);与之相反,切脾停止打CCl_4组(B组)较假手术停止打CCl_4组(D组)外来巨噬细胞(F4/80~(low)CD11b~(high))占非实质细胞数目的比例有升高趋势,但无统计学差异。【结论】1.CCl_4小鼠肝纤维化模型中,造模4周后停止注射CCl_42周,纤维化明显逆转。肝纤维化进展时切脾导致纤维化程度减轻;肝纤维化修复过程中,切脾使纤维化程度加重。2.造模4周后停止打CCl_4的小鼠肝纤维化修复模型中,脾脏可能促进活化的肝星状细胞凋亡及衰老。3.CCl_4造模小鼠肝纤维化进展与修复过程中,从脾脏迁移到肝脏内的巨噬细胞可能影响活化肝星状细胞的衰老与凋亡,进而影响肝纤维化。
【学位授予单位】：延安大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.2;R-332

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本文编号：2594034