沙利度胺对大鼠肾移植模型慢性排斥反应的保护作用及机制研究
发布时间：2020-03-21 23:42
【摘要】：诱导成功的移植耐受可以使人类跨过免疫系统的天然障碍,真正的完成器官“置换”的终极目标;成功的免疫耐受不仅可以延长移植物存活时间,而且可以缓解器官移植带来的巨大经济负担、患者身心压力和器官短期的医疗局面。现阶段治疗方案虽然能减少急慢性排斥反应发生,却无法达到耐受。肾移植术后随访4至5年,大约30%病人会呈现慢性排斥的病理表现。因此,当前移植学界的首要目标就是探求新的免疫抑制方案。大鼠肾脏移植模型具有通过可适用于人类情况的手段研究耐受性诱导的潜力,研究者可以通过操控大鼠肾移植排斥反应,理解其发病机制。泌尿道的重建技术是大鼠肾移植模型的关键技术之一,因为大鼠输尿管的口径极窄,易导致尿漏、输尿管坏死和输尿管狭窄等并发症,可致移植肾积水或移植肾功能恶化。不同的泌尿道重建术式也会导致肾移植的不同结局。我们在建立大鼠肾移植模型时采用包含输尿管的供体小膀胱瓣-受体膀胱双层缝合技术重建泌尿道,同时与供体膀胱瓣-受体膀胱吻合的方法进行比较,以期改良泌尿道重建方法,减少并发症的产生。我们前期的研究发现沙利度胺可以显著减轻大鼠血管移植物动脉粥样硬化,减轻移植物血管病。其机制为改善炎症反应,减轻淋巴细胞的浸润,减少VEGF、PDGF、ICAM、TNF-α及PCNA的表达,延缓移植血管的硬化进程以及减轻内膜增生。在本实验中我们通过建立改良的供体小膀胱瓣-受体膀胱双层缝合尿路重建建立大鼠肾移植模型,观察沙利度胺对大鼠肾移植急、慢性排斥的作用,并阐明其免疫学机制。通过混合淋巴细胞培养,观察沙利度胺在体外对异体反应性T细胞的增殖及分化等情况的影响,阐明其对反应性淋巴细胞的调控机制。第一部分:改良的供体小膀胱瓣-受体膀胱双层缝合建立大鼠肾移植模型目的:应用改良的供体小膀胱瓣-受体膀胱双层缝合泌尿道重建建立大鼠肾移植模型,与供体膀胱瓣-受体膀胱吻合的方法进行比较,明确改良的大鼠肾移植泌尿道重建方式的效果。方法:分别以供体小膀胱瓣-受体膀胱双层缝合泌尿道重建及供体膀觥瓣-受体膀胱吻合泌尿道重建的方式建立大鼠肾移植模型:A组,供体小膀胱瓣-受体膀胱粘膜层浆肌层双层缝合(n=12):B组,供体膀胱瓣-受体膀胱单层缝合(n=11)。对比泌尿道重建时间及并发症。结果:A组尿路重建时间为14.12±1.73min、B组尿路重建时间为10.16±1.19min,两组差异有统计学意义(P0.05);A组泌尿道并发症发生率为25%,B组泌尿道并发症发生率为9.09%,两组差异有统计学意义(P0.05)。结论:改良的供体小膀胱瓣-受体膀胱双层缝合的泌尿道重建方式能减少大鼠肾移植术后泌尿系统并发症,尽管尿路重建时间时间较传统的单层缝合时间长,但可以显著减少尿漏的可能性,为可靠性高的重建术式。第二部分:沙利度胺对大鼠肾移植急性排斥反应的作用目的:阐明沙利度胺在大鼠肾移植急性排斥反应中的作用。方法:建立Fischer到Lewis大鼠肾移植模型。使用同系LEW-LEW移植物作为对照。将受体大鼠分为同系移植组(Isograft,Iso)、异系移植组(Allograft,Allo)、环孢素组(CsA)和沙利度胺组(Thalidomide,Tha)。动态监测术后肌酐(Scr)的变化,观察至术后5天,留取血液标本检测白细胞介素(IL)-2、IL-6、IL-17和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度,移植肾行病理检查。结果:急性排斥模型中Allo组及Tha组大鼠肌酐均进行性升高,Tha组肌酐水平与Allo组相比无明显差异,均显著高于同时间点Iso组及CsA组。Tha组移植肾病理学改变与Allo组相似,均可见急性肾小管损伤表现,弥漫性重度炎症浸润伴严重肾小球病,内膜动脉炎和小动脉透明变性。Allo组IL-2、IL-6、IL-17和TNF-α的浓度显著升高,Tha组血清中IL-6、IL-17和TNF-α的浓度显著低于Allo组,但IL-2的浓度显著高于Allo组。结论:这些结果表明,沙利度胺的免疫抑制作用较弱,对急性排斥反应效果较差。第三部分:沙利度胺对大鼠肾移植慢性排斥反应的作用及其免疫调节机制的初步研究目的:观察沙利度胺对大鼠肾移植模型慢性排斥反应的作用,并明确其确切的机制。方法:建立Fischer到Lewis大鼠肾移植模型。使用同系LEW-LEW移植物作为对照。将受体大鼠分为同系移植组(Isograft,Iso)、异系移植组(Allograft,Allo)和沙利度胺组(Thalidomide,Tha)。术后8周取血液测定受者血清中肌酐,IL-2、IL-6、IL-17和TNF-α的浓度;流式细胞术检测外周血中T细胞亚群分布。取移植肾行病理检查;免疫荧光、蛋白印迹实验检测各组肾组织中转换生长因子β1(TGF-βl)、平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达。结果:肾移植后8周,移植肾出现不同程度的单个核细胞浸润、肾小球硬化、肾小管萎缩、间质纤维化和小动脉内膜厚等病理学改变。Tha组大鼠移植肾的病理改变明显轻于Allo组。Tha组大鼠血肌酐水平及血清中炎性细胞因子的浓度显著低于Allo组,Tha组外周血中CD4+CD25+、CD4+CD25+FoxP3+T细胞比例显著升高、CD4+Th17+T细胞比例显著降低,TGF-β1,α-SMA和VEGF蛋白的表达显著降低。结论:沙利度胺可以显著减轻慢性排斥反应,其机制可能为沙利度胺减少炎症因子的分泌,改变T细胞亚群的分布,并降低相关致纤维化蛋白表达有关。第四部分:沙利度胺对异体反应性淋巴细胞的调控作用目的:观察沙利度胺在体外对体反应性淋巴细胞的影响,阐明其对反应性淋巴细胞的免疫调控作用。方法:建立Fischer-Lewis单向混合淋巴细胞培养(Mixed lymphocyte culture MLC)体系,分为对照组(Control,Con)及沙利度胺组(Thalidomide,Tha),流式细胞术检测T细胞亚群分布情况及凋亡率,ELISA法测定培养液中IL-2,IL-6,IL-17和TNF-α的浓度。结果:Tha组中Th17细胞比例显著低于同时间点的对照组,Treg细胞比例均显著高于同时间点的Con组,差异均有统计学意义(P0.05):Tha组培养液中IL-2浓度显著高于同时间点的Con组(P0.05);Tha组中T细胞凋亡率显著高于同时间点的Con组,差异均有统计学意义(P0.05);而IL-6,IL-17和TNF-α浓度显著低于同时间点的Con组(P0.05)。结论:沙利度胺在体外可以促进异体反应性T细胞中Treg细胞增殖,抑制Th17细胞增殖,改变T细胞亚群分布,增加异体反应性T细胞凋亡,降低炎症因子IL-6,IL-17和TNF-α的浓度。
【图文】：
Ｃｏｎｔｒｏｌ：对照组；Ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ：沙利度胺组。逡逑图２各组混合淋巴培养体系中ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ细胞亚群分布逡逑６ｈ逦１２ｈ逦２４ｈ逡逑１０＜邋ｊｅＵ逦Ｖｉ２＜％邋，0逦４２？＊逦１0４＇邋？ｍ逦？ｓｉ％逡逑ｉ邋ｉｊ逦ｒ、逦ｉ，，0３］逡逑ｇ邋Ｉ邋ｉ0３ｊ逦１逦，0２；逦Ｉ逡逑０１邋，１邋．．逦ｉ邋，，，S茫邋邋澹慑澹拢澹咤危义稀＃卟峰危峰澹湾澹垮危海浚唬惧澹湾义希
本文编号：2594108
【图文】：
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