诱导多能干细胞来源小胞外囊泡提取方法的建立及优化

发布时间：2020-03-22 03:04

【摘要】：研究目的:近年来已有大量研究证明诱导多能干细胞(hi PSCs)来源的小胞外囊泡(s EVs)(hi PSCs-s EVs)在各类疾病中发挥治疗作用,然而目前对于s EVs来源供体细胞的收集培养上清时所用培养液条件及细胞状态并没有明确的报道,因此本文研究的目的是探索在提取hi PSCs-s EVs时,hi PSCs的培养条件及其能否维持细胞的正常状态,以确保在减少外来物质对s EVs干扰的同时提取具有生物学活性的s EVs。1、根据hi PSCs的生长及分化状态确定收集培养上清时所需条件培养基的组成;2、进一步确定可收集培养上清的天数;3、改良s EVs的提取方法提取hi PSCs来源的s EVs;4、通过检测形态、大小等验证提取的s EVs的物理学特性;5、验证s EVs表面标志蛋白的表达;6、利用Hep G2细胞证明提取的s EVs的生物学活性。研究方法:1、利用连续16h超速离心法制备去除细胞外囊泡的血清替代物(KSR)(ED-KSR);2、配制含有不同浓度(0%、0.25%、0.5%、2%、5%和20%)ED-KSR的条件培养基(CM);3、hi PSCs生长至一定密度后更换不同浓度CM,24h后利用相差显微镜观察细胞形态,流式细胞仪检测不同浓度CM中细胞的生存率,BCA和SDS-PAGE分别测定不同浓度CM中提取出的s EVs蛋白浓度以及条带分布,并确定最适宜的ED-KSR浓度;4、在0.5%CM中连续收集培养上清5d,并利用流式细胞仪测定分别收集1d,3d,5d时hi PSCs的存活率,碱性磷酸酶染色(ALP)、干性标志物OCT4、SEEA4和SOX2的免疫荧光染色、干性标志物NANOG、OCT4和SOX2的q RT-PCR分析检测hi PSCs的多能性,确定收集培养上清的时间;5、采用改良的超速离心法(M-UC)和Exo-Quick试剂盒(EQ)提取s EVs,并利用透射电子显微镜(TEM)、纳米颗粒追踪分析(NTA)、蛋白印迹(WB)验证所提取的s EVs的大小、形态以及蛋白表达;6、PKH67标记s EVs,鉴定是否能被受体细胞Hep G2摄取;7、不同浓度的s EVs加入到Hep G2中,观察其对受体细胞的作用。研究结果:更换0%、0.25%、0.5%、2%、5%和20%六种浓度ED-KSR配制的CM 24h后,相差显微镜下观察两株hi PSCs的形态,发现与干细胞培养基中培养的hi PSCs相比,0.5%、2%、5%和20%CM中的细胞形态没有显著变化,均呈特征性的未分化状态,且流式细胞仪检测结果的数据分析显示各组间差异无统计学意义(P0.05),然而,0%和0.25%CM中hi PSCs的形态已经发生轻微改变,并开始出现分化现象,细胞存活率也显著低于对照组(P0.05);BCA结果显示0.5%、2%、5%和20%CM中收集的来源于两株hi PSCs的s EVs的蛋白浓度分别为4.36±0.53、7.5±2.0、10.2±1.2、14.99±1.12;4.36±0.54、7.14±0.68、10.67±1.84、13.63±0.06,各组间差异显著(P0.05),且SDS-PAGE结果也显示KSR中的蛋白对0.5%CM中提取的s EVs干扰最小,上述结果均表明0.5%ED-KSR为适宜的CM浓度;随后在0.5%CM中连续收集培养上清5天后,发现细胞的形态无明显变化,且流式细胞仪检测结果显示hi PSCs的存活率有浮动,但数据分析显示此差异无统计学意义(P0.05);碱性磷酸酶染色、OCT4、SEEA4和SOX2的免疫荧光、NANOG、OCT4和SOX2的q RT-PCR分析结果均显示hi PSCs在收集5天后仍表达hi PSCs多能性标志,呈未分化状态;采用M-UC和EQ两种方法提取s EVs,TEM结果显示提取的s EVs均为50-200nm,椭圆形或圆形的双层膜性小囊泡,NTA结果显示两种方法提取的s EVs大小分别为186.6±2.6 nm、167.5±2.0 nm,;Western Blotting结果显示两株hi PSCs细胞来源的s EVs表达标记蛋白CD63,TSG101和HSP70,不表达钙网蛋白Calreticulin;另外,PKH67染色实验表明,s EVs可被受体细胞Hep G2内吞,并以颗粒形式聚集在细胞质中,且达到一定浓度的s EVs可以促进细胞增殖。研究结论:在维持hi PSCs多能性及存活率的条件下,0.5%ED-KSR为收集hi PSCs培养上清时所用条件培养基的适宜浓度,并且可连续收集5天;M-UC和EQ两种方法均可提取具有促进受体细胞增殖的生物活性的s EVs,为后续的功能研究提供基础。
【图文】：

12图 1.1 小胞外囊泡（sEVs）的提取方法检测RIPA 裂解液（Radio Immunoprecipitation Assaris (pH 7.4) 、 150mM NaCl 、 1% Trholate、0.1% SDS 以及 sodium orthovanadate、E蛋白降解；②PMSF(100 mM, Phenylmethanesul蛋白酶抑制剂，，工作浓度为 1mM。按照以下步 RIPA 裂解液，轻摇混匀。取适量的裂解液， PMSF 的最终浓度为 1mM（通常 6 孔板每孔细胞密度非常高时可以适当加大裂解液的用量

单因素方差分析比较组内的平均值，并使用独立样本 t 检验方法分析软件为 SPSS Statistics ver 22.0，其中 P <0.05 表示具有显著标记。所有实验数据至少重复三次。分析软件荧光图片处理软件采用 Image-Pro Plus 5.0；细胞流式分析软7.6；数据统计学分析软件采用 IBM SPSS Statistics 22；统计学图制作 GraphPad Prism 7；图片处理软件采用 Adobe Photoshop C果常培养条件下 2 株 hiPSCs 的镜下观察 1.1 所示，在 TeSR-E8TM和 mTeSRTM1 两种完全培养基中，正常Cs 聚集在一起形成紧凑的多细胞集落，这些集落都具有明显的边镜下可观察到成簇的明亮细胞，且细胞排列紧密；
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R329.2

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 苏竞梅;;生殖衰老的生育困境(下)[J];人人健康;2017年09期

2 ;全球首例血液与大脑屏障建模成功[J];大众科学;2017年05期

3 王皓帆;;抑制p53-p21通路诱导多能干细胞的生成[J];中国病理生理杂志;2010年01期

4 曹尚涛;余胜勇;李东伟;Jing Ye;Xuejie Yang;Chen Li;Xiaoshan Wang;Yuanbang Mai;Yue Qin;Jian Wu;Jiangping He;Chunhua Zhou;He Liu;Bentian Zhao;Xiaodong Shu;Chuman Wu;Ruiping Chen;Waiyee Chan;Guangjin Pan;Jiekai Chen;刘晶;裴端卿;;化学小分子诱导多能干细胞过程染色质可及性动态变化规律[J];科学新闻;2019年02期

5 王记;陆玉琴;徐鑫;纪召娟;;抑瘤素M促进小鼠诱导多能干细胞向心肌分化[J];基础医学与临床;2017年10期

6 夏朦;侯伟健;柏树令;敖强;;诱导多能干细胞的研究进展[J];中国民康医学;2015年14期

7 温玉琴;;研究发现诱导多能干细胞可用作癌症疫苗[J];广东药科大学学报;2018年01期

8 ;用诱导多能干细胞能再生完整皮肤[J];广州医科大学学报;2016年02期

9 ;诱导多能干细胞机理与技术研究:跻身世界先进行列[J];广东科技;2010年15期

10 李艺雯;邹松;;为了中国科技人的光荣与梦想[J];国际人才交流;2019年12期

相关会议论文 前10条

1 王美婷;汪溪洁;;人诱导多能干细胞在药物体外安全性评价中的应用[A];中国毒理学会第九次全国毒理学大会论文集[C];2019年

2 新浪综合;;全球首例!用他人诱导多能干细胞治眼病[A];《科学与现代化》2018年第1期（总第074期）[C];2018年

3 严庆丰;;疾病特异性诱导多能干细胞研究[A];2015年浙江省医学遗传学学术年会暨高通量基因测序产前筛查与诊断技术研讨会论文汇编[C];2015年

4 李铮;胡洪亮;李朋;郭熙志;刘平;张伟;张玲玲;史占平;田汝辉;黄翼然;;诱导多能干细胞经体内外诱导向精子细胞分化研究[A];第十七届全国泌尿外科学术会议论文汇编[C];2010年

5 蒋春艳;董娟;廖婷婷;宁松;薛志刚;崔毓桂;刘嘉茵;范国平;曾桥;;建立人诱导多能干细胞系及向神经系统分化研究[A];中华医学会第六次全国生殖医学学术会议专刊[C];2012年

6 蒋春艳;董娟;廖婷婷;宁松;范国平;曾桥;薛志刚;崔毓桂;刘嘉茵;;建立人诱导多能干细胞系及向神经系统分化研究[A];中华医学会第八次全国计划生育学术会议论文汇编[C];2012年

7 孙玉华;赵荧晖;任晓帅;邓怡;徐安秀;魏世成;;多肽修饰紫外交联甲基丙烯酸化透明质酸膜培养人诱导多能干细胞[A];第八届全国口腔材料学术交流会暨中华口腔医学会口腔材料专业委员会2013年会论文集[C];2013年

8 崔笑笑;崔亚洲;时良;栾静;周小艳;韩金祥;;诱导多能干细胞到破骨细胞分化的探索[A];第八届泛环渤海生物化学与分子生物学会2018年学术交流会论文集[C];2018年

9 李朋;杨施;胡洪亮;田汝辉;朱勇;马猛;黄翼然;何祖平;李铮;郭熙志;;诱导多能干细胞体外培养与重构生精小管诱导精子发生机制研究[A];中华医学会第六次全国生殖医学学术会议专刊[C];2012年

10 齐自娟;崔亚洲;时良;栾静;周小艳;韩金祥;;诱导多能干细胞鉴定中启动子甲基化实验条件探索[A];2017第七届泛环渤海生物化学与分子生物学会学术交流会论文集[C];2017年

相关重要报纸文章 前10条

1 李洁尉　韩青海 朱丹萍;尿液是诱导多能干细胞理想来源[N];科学时报;2011年

2 记者 李洁尉　通讯员 朱丹萍;体细胞“变身”障碍破解[N];科学时报;2011年

3 本报记者 刘霞;诱导多能干细胞治心脏病，希望还是隐忧？[N];科技日报;2018年

4 记者 陈超 刘霞;全球首例!用他人诱导多能干细胞治眼病[N];科技日报;2017年

5 记者 范建;我科学家发现一个基因影响诱导多能干细胞质量[N];科技日报;2014年

6 杞人　朝胜;我科学家将诱导多能干细胞转化效率提高到10%[N];科技日报;2009年

7 本报记者 汪立乐;首例“超级供体”诱导多能干细胞株“安徽造”[N];中国产经新闻;2018年

8 记者 华义;用诱导多能干细胞能再生完整皮肤[N];科技日报;2016年

9 记者 张建列 通讯员 黄博纯;为高效获得诱导多能干细胞提供新思路[N];广东科技报;2016年

10 记者 白毅;人诱导多能干细胞构建再生牙齿获成功[N];中国医药报;2013年

相关博士学位论文 前10条

1 华永泉;叶酸多肽水凝胶联合诱导多能干细胞移植治疗小鼠心肌梗死的作用及机制研究[D];南方医科大学;2018年

2 秦鼎新;肿瘤细胞来源的诱导多能干细胞研究[D];北京协和医学院;2010年

3 薛燕婷;尿液分离细胞来源非整合人诱导多能干细胞库的建立[D];中国科学技术大学;2013年

4 邸科前;小鼠雌性诱导多能性干细胞的分离与多能性研究[D];河北农业大学;2015年

5 刘锴;建立安全有效的猪的诱导多能干细胞[D];南开大学;2014年

6 刘静馨;癫痫病人诱导多能干细胞来源的神经元中Nav1.1突变效应及其致病机理研究[D];中国科学技术大学;2016年

7 张高川;诱导多能干细胞和肿瘤干细胞中致瘤基因的生物信息学分析[D];苏州大学;2014年

8 邓彦飞;水牛诱导多能干细胞的研究[D];广西大学;2012年

9 史慧君;高效制备绵羊诱导多能干细胞的研究[D];石河子大学;2015年

10 刘日渊;经腰椎穿刺注射干细胞内耳移植新途径的探索研究[D];中国人民解放军医学院;2016年

相关硕士学位论文 前10条

1 高敦芹;诱导多能干细胞来源小胞外囊泡提取方法的建立及优化[D];天津医科大学;2019年

2 郎正鹏;人诱导多能干细胞的构建及向血管平滑肌细胞诱导分化的实验研究[D];遵义医科大学;2019年

3 王旭东;人诱导多能干细胞系的建立[D];内蒙古大学;2019年

4 吴轩;基于人源诱导多能干细胞构建三维神经网络的研究[D];江汉大学;2019年

5 齐自娟;苯丙酮尿症尿液来源非整合诱导多能干细胞建系及拟胚体成骨分化[D];济南大学;2018年

6 付尚峰;烧伤患者特异性非整合诱导多能干细胞的建立与鉴定[D];南昌大学;2018年

7 刘益;建立人外周血单个核细胞来源的诱导多能干细胞[D];重庆医科大学;2018年

8 崔思颖;杜氏肌营养不良患胎绒毛来源非整合诱导多能干细胞的建立与鉴定[D];郑州大学;2018年

9 赵霞;血管内皮生长因子对诱导多能干细胞向心肌细胞分化的影响[D];重庆医科大学;2012年

10 殷欣;诱导多能干细胞转录因子在肝细胞癌复发及转移的作用研究[D];复旦大学;2011年

本文编号：2594372