酯酰辅酶A胆固醇酰基转移酶1对BCG诱导巨噬细胞自噬的调控作用研究

发布时间：2020-03-23 19:51

【摘要】：结核分枝杆菌(Mycobacterium tubercuLosis,Mtb)是引起人和动物结核病的病原体。巨噬细胞作为Mtb的主要靶细胞和免疫细胞,在抗Mtb感染中发挥着重要作用。研究表明,巨噬细胞可通过自噬途径有效清除Mtb,而Mtb也可通过某些机制逃避自噬的清除作用。酯酰辅酶 A 胆固醇酰基转移酶(Acyl Coenzyme ACholesterol Acyltransferases,ACAT)蛋白家族在体内胆固醇吸收与代谢平衡中发挥着重要作用。ACAT1是游离胆固醇酯化的关键酶,广泛存在于动物组织和细胞中。ACAT1的高表达可影响胞内胆固醇代谢平衡并促进巨噬细胞泡沫化,也可对细胞自噬水平产生影响。为了探究ACAT1对Mtb诱导巨噬细胞自噬的调控作用及其机制,本研究在BCG感染巨噬细胞的基础上,分别采用ACAT1抑制剂阿伐麦布(Avasimibe)、mTOR抑制剂雷帕霉素(Rapamycin)处理 RAW264.7 细胞、牛肺泡巨噬细胞(Bovine alveolar macrophages,BAMs)及在RAW264.7细胞中过表达/干扰ACAT1后,检测ACAT1蛋白、自噬相关蛋白、PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达及胞内胆固醇水平的变化。实验结果如下:1.BCG感染BAM和RAW264.7细胞2h、6h、12h、24h后,随感染时间的延长,ACAT1蛋白表达量、胞内胆固醇酯含量和胞内脂滴先下降后上升,RAW264.7细胞中12h最低,而BAMs中6h最低,而胞内游离胆固醇含量与之相反。随BCG感染时间的延长,自噬相关蛋白Beclin1和LCⅡ/Ⅰ的表达量先上升后下降,RAW264.7细胞中12h最高,而BAMs中6h最高。结果提示,BCG感染巨噬细胞后,ACAT1可通过改变胞内胆固醇水平影响细胞自噬水平。2.采用慢病毒转染,并经RT-PCR及Western blot方法验证,成功获得了 ACAT1过表达/干扰的RAW264.7稳定转染细胞株,为后续探究ACAT1在BCG诱导巨噬细胞自噬中的调控作用提供了实验材料。3.用Avasimibe处理RAW264.7细胞和BAMs,并经BCG感染12h后,自噬相关蛋白Beclin1、Atg5、Atg7和LC3Ⅱ/Ⅰ的表达量显著升高。结果表明,抑制ACAT1可促进BCG诱导的巨噬细胞自噬。4.BCG感染ACAT1过表达的RAW264.7稳定转染细胞株12h后,自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg5和Atg7的表达量显著降低,同时胞内游离胆固醇含量亦显著降低,胆固醇酯含量显著升高;BCG感染ACAT1干扰的RAW264.7稳定转染细胞株12h后,自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg5和Atg7表达量显著升高,同时胞内游离胆固醇含量亦显著升高,胆固醇酯含量显著降低。结果证实,BCG感染巨噬细胞后,ACAT1可通过降低胞内胆固醇酯含量从而促进细胞自噬。5.采用Rapamycin处理RAW264.7细胞和BAMs,并经BCG感染12h后,ACAT1蛋白表达下调。结果表明,PI3K/mTOR信号通路通过影响ACAT1表达进而调控BCG诱导的巨噬细胞自噬水平。6.干扰或抑制ACAT1,并经BCG感染巨噬细胞12h后,PI3K/mTOR信号通路相关蛋白PI3K、mTOR、P-mTOR和P-Akt蛋白的表达显著下调;而过表达ACAT1并经BCG感染巨噬细胞12h后,PI3K/mTOR信号通路相关蛋白PI3K、mTOR和P-mTOR蛋白的表达显著上调。结果表明,BCG感染巨噬细胞后,ACAT1对PI3K/mTOR信号通路介导的自噬具有调控作用。上述结果显示,在BCG感染巨噬细胞后,ACAT1通过影响胞内胆固醇水平,并与PI3K/Akt/mTOR信号通路协同作用发挥对巨噬细胞自噬的调控作用。
【图文】：

逦第一章文献综述逡逑直接包裹部分胞质进入溶酶体［２７］。分子伴侣介导的自噬则是由特定蛋白介导的选择性功能逡逑自噬，该过程由靶向基序ＫＦＥＲＱ所控制ｐ８］（图１－１）。逡逑Ｃ－邋ＫＫＥＲＱ邋Ｍｏｌｉｆ邋Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ逡逑／逦Ｌｙ，邋°邋Ｃ邋＼ｊ逦Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ逦，逦＼逡逑／逦丨１逦ａｕｔｏｐｈａｇｙ逦＼逡逑图１－１细胞自噬的分类［２９］逡逑Ｆｉｇ邋１－１邋Ｔｈｒｅｅ邋ｔｙｐｅ邋ｏｆ邋ａｕｔｏｐｈａｇｙ逡逑巨自噬发生过程非常复杂，包括三个阶段：自噬启动阶段、自噬体装配和形成阶段、逡逑自噬溶酶体形成及自噬溶酶体降解阶段（图１－２）。自噬的起始：在酵母细胞中，特异性自逡逑嗤体前体结构〔ＰＡＳ）招募其他自嗤相关基因（ａｕｔｏｐｈａｇｙａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｅｎｅ，Ａｔｇ）蛋白及囊泡逡逑等膜成分，形成双层膜结构，因此ＰＡＳ的形成是自噬发生的必要条件之一逡逑自噬的发生调节，受许多因素调控［３２］。自噬的起始途径主要包括ＵＬＫ１复合物、磷脂酰逡逑肌醇３－激酶复合物和Ａｔｇ９循环机制的激活当细胞营养充足时

ＡＣＡＴ主要以ＦＣ和长链脂肪酸酰基辅酶Ａ作为脂肪酰基供体，将ＦＣ酯化为ＣＥ。胞膜上ＦＣ的过度积累导致细胞产生脂毒性。因此．ＡＣＡＴ酯化作用在防止细胞脂毒性过中至关重要［８１］。逡逑在哺乳类动物中．ＡＣＡＴ基因有两种亚型，分别是ＡＣＡＴ１基因和ＡＣＡＴ２基因，编两种不同的酯化酶。其中ＡＣＡＴ１在哺乳动物机体组织细胞中都有分布（如：肝脏、皮肤肠上皮细胞、星形胶质细胞和巨噬细胞），将ＦＣ酯化成ＣＥ以脂滴的形式储存。ＡＣＡＴ２主要特异性分布于小肠和肝脏中，将ＦＣ酯化为ＣＥ．并以乳糜微粒和低密度脂蛋白两种式包装ＣＥ邋［８２Ｌ逡逑ＡＣＡＴ在全身胆固醇代谢平衡中起到重要的调节作用。小肠绒毛上皮细胞摄取ＦＣ，量的ＦＣ被ＡＣＡＴ２酶酯化为ＣＥ．最后以乳糜微粒形式参与全身循环。然而，进入肝脏中ＣＥ通过胆固醇酯水解酶（ＣＥＨ）水解为ＦＣ，再次被ＡＣＡＴ２酯化为ＣＥ［８３］。在巨噬细胞中，逡逑ＡＣＡＴ１将ＦＣ酯化成ＣＥ，储存在细胞内，从而调节胆固醇／胆固醇酯比率，另一部分通ＣＥＨ水解为ＦＣ外流出细胞．从而组装成高密度脂蛋白（ＨＤＬ），最终以ＨＤＬ形式参与胆醇的逆向转运机制［８４］。由于存在血脑屏障作用，导致外周胆固醇不能直接进入到脑部，，而由胶质细胞直接在脑部合成胆固醇进行生理活动的需要＝邋ＡＣＡＴ１将一部分过量的ＦＣ酯化，逡逑另一部分被胆固醇２４－羟化酶合成２４－羟基胆固醇直接通过血脑屏障进入脑部，最终被低度脂蛋白（ＬＤＬ）运回肝脏，再次代谢［８５］（图１－３）。逡逑
【学位授予单位】：宁夏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q255;R392

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