含结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白疫苗的构建及免疫原性分析

发布时间：2020-03-23 17:20

【摘要】：目的:拟靶向结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)感染多阶段特异性表达的抗原,设计并构建包含多个靶抗原的融合蛋白SHR3;检测SHR3及其亚组分蛋白能否被安徽省淮南市M.tb感染者外周血T淋巴细胞免疫识别;以SHR3联合佐剂DMT免疫C57BL/6小鼠,并评价其免疫原性。方法:1.选择M.tb感染后的分泌期、潜伏期和复苏期特异性表达抗原Rv1626、Rv2866和Rv1884,构建融合蛋白SHR3及其亚组分蛋白的重组表达质粒,分别进行原核表达、纯化、SDS-PAGE 和 Western blotting 鉴定。。2.依据结核病(Tuberculosis,TB)临床诊断标准筛选临床受试者,分为感染者(包括TB患者和潜伏感染者)与健康对照者。利用全血干扰素释放分析技术(Whole-blood IFN-γrelease assay,WBIA)检测 SHR3 及其亚组分蛋白诱导M.tb感染者及健康对照者外周血淋巴细胞产生的特异性干扰素-γ(Interferon-gamma,IFN-γ)水平及其差异;并在特异性抗原SHR3刺激受试者外周血淋巴细胞后,以流式细胞术检测抗原特异性IFN-γ和IL-2单阳及双阳的CD4+、CD8+T细胞总数并比较差异。3.制备亚单位融合蛋白疫苗SHR3/DMT,将C57BL/6小鼠分为PBS阴性对照组、DMT对照组、BCG阳性对照组、SHR3/DMT组和BCG+SHR3/DMT组。按相应的免疫方案皮下免疫各组小鼠,9周后处死。以ELISA检测其抗原特异性抗体滴度;脾淋巴细胞分泌的抗原特异性IL-4、IL-2、TNF-α和IFN-γ水平;以及以qRT-PCR检测肺脏抗原特异性IL-4、IL-2、TNF-α和iNOS的表达水平。结果:1.成功构建、表达、纯化融合蛋白SHR3及其亚组分蛋白,以SDS-PAGE和Western blotting证实SHR3及其亚组分蛋白鉴定正确,同时具有较高的纯度和生物学活性。2.SHR3及其亚组分蛋白刺激M.tb感染者淋巴细胞产生的IFN-γ水平,以及诱导产生的IFN-γ、IL-2单阳及双阳的CD4+和CD8+T细胞数均显著性高于健康对照组。3.SHR3/DMT诱导小鼠产生显著高水平的IgG抗体及其亚类,IgG2a/IgG1结果显示趋向Th1型应答;同时诱导小鼠肺脏组织IFN-γ、TNF-α及iNOS表达水平显著高于PBS组和DMT组。无论以PPD或SHR3刺激,BCG+SHR3/DMT组小鼠均诱导分泌最高水平的总IL-2、IFN-γ和TNF-α,且显著高于PBS组和DMT组(P0.05)。结论:以安徽省淮南市M tb感染者T细胞识别的M tb多阶段靶抗原构建融合蛋白SHR3,可诱导M tb感染者外周血淋巴细胞分泌高水平IFN-γ,以及诱导数量较多的IFN-γ、IL-2单阳及双阳的CD4+和CD8+T细胞。SHR3/DMT可诱导免疫后小鼠产生显著高水平IL-2和IFN-γ。上述实验结果均证实SHR3可诱导高水平的抗原特异性CD4+Th1型应答。本研究为在动物模型中进一步评价SHR3抗Mtb感染的保护性建立了研究基础。图15;表8;参57;
【图文】：

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【学位授予单位】：安徽理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392

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