脂肪干细胞外泌体提取方法的改良及其对成骨效应的影响

发布时间：2020-03-23 21:31

【摘要】：目的:外泌体(exosomes)的直径多介于30-150nm,净化非常困难,目前已知的提取方法有多种,其中超速离心法以及溶剂沉淀法被广泛应用。本次实验为了更高效的从脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)中提取exosomes,分别采用ExoQuick试剂盒法、超速离心法、ExoQuick试剂盒改良法进行操作。Exosomes拥有的生物学活性物质与其来源细胞类似,可在细胞间进行信息传递,发挥各种生物学功能。取成骨分化诱导方向的ADSCs,加入exosomes,经透射电镜、Western Blot检测,判断加入的exosomes是否增强ADSCs的成骨效能,并对这三种提取方法进行比较。研究方法:提取并培养ADSCs,传代至带三代,镜下观察细胞形态及生长状态。对第三代ADSCs进行成脂、成软骨诱导,分别于14天进行油红O染色以及28天进行Alican染色,镜下观察诱导结果。对第三代ADSCs进行流式细胞仪分析,检测CD10、CD31、CD34表达。使用ExoQuick试剂盒法、超速离心法、ExoQuick试剂盒改良法提取第三代ADSCs来源exosomes,使用透射电镜进行形态学观察。Western Blot法对exosomes进行检测,观察CD9、CD63蛋白表达情况;分别将3种方法提取的exosomes加入成骨诱导液中,并设置一组不加exosomes的成骨诱导液作为空白对照,将以上4组分别用于ADSCs成骨分化诱导过程中,通过对照实验检测4组ADSCs形态学变化及Runx2、OCN蛋白表达。结果:1、电镜下可见第三代ADSCs细胞形态均一,呈明显方向性。2、ADSCs成脂诱导后,经油红O染色镜下观察,胞浆内脂滴被染成红色;ADSCs成软骨诱导后经Alican染色镜下观察,胞质及细胞外基质染色蓝色。3、ADSCs经过流式检测,CD10表达阳性、*CD31表达阴性、*CD34表达阴性,符合ADSCs表型,表明所分离培养的细胞为ADSCs。4、3种提取方法获得的样本均可见到圆形、类圆形的膜性囊泡样结构,特异性表面标志物CD9、CD63均可表达,且ExoQuick试剂盒改良法蛋白表达量最多;5、与未加exosomes的过程相比加入exosomes的ADSCs成骨诱导过程Runx2、OCN蛋白表达明显增多,且ExoQuick试剂盒改良法蛋白表达量最多。结论:ExoQuick试剂盒改良法为提取ADSCs-Exos的最优方法;提取的exosomes具备进入ADSCs的活性,促进ADSCs的成骨分化,且ExoQuick试剂盒改良法提取的exosomes诱导效果最好。
【图文】：

ADSCs形态学观察（倒置显微镜x50）

图 2 ADSCs鉴定结果（倒置显微镜 x100）A为ADSCs成脂化诱导油红O染色结果。B为ADSCs成软骨化诱导Alican染色结果。C为SCs流式细胞仪检测结果
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R329.2

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本文编号：2597292