基于GC-MS技术的慢加急性肝衰竭动物模型的代谢组学分析

发布时间：2020-03-24 02:20

【摘要】：目的:深入了解慢加急性肝衰竭的具体代谢过程,为慢加急性肝衰竭的机制研究指明方向。同时探索诊断及评价慢加急性肝衰竭的新指标,改变临床依赖生化等单一指标的困境,为疾病的诊断及评估提供新的可能指标。方法:通过胆管结扎制作胆汁淤积型肝硬化的SD大鼠,饲养1月后,使用D-半乳糖胺诱导制造慢加急性肝衰竭的大鼠模型。分别在给药前Oh和给药后的不同时间点(24h,36h,48h)麻醉大鼠并取材。并取Control组.(行假手术)大鼠作为对照。部分组织样本送病理室切片,其余进行匀浆。将组织匀浆及血浆样本进行基于气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术的代谢组学的分析。获得的原始数据使用R软件进行处理后,得到原始数据表。将原始数据表导入SIMCA-P等软件进行统计学分析,筛选组织中的差异性代谢产物,分析慢加急性肝衰竭过程中涉及的重要代谢通路,并追踪这些产物在血浆中的变化趋势。结果:大鼠手术后出现腹水、胆管膨出等表现,生化指标提示,与Control组相比,BDL组与ACLF组均出现肝脏损伤,病理HE染色证实肝衰竭模型造模成功。多元统计学分析示各组区分度良好,通过VIP值等筛选鉴定出组织与血浆中发生明显变化的产物主要集中在氨基酸类、部分糖类及少量脂肪酸。涉及的代谢通路主要是支链与芳香族、含硫氨基酸等的生物合成与代谢,淀粉、蔗糖、半乳糖等糖类的代谢及甘油酯、类固醇、部分磷脂的合成与代谢。动态监测这这些差异性物质的含量变化,发现其中6种与肝损伤程度有良好的相关性,为磷酸、酪氨酸、色氨酸、尿素、甘油、磷酰乙醇胺,可作为临床评估肝损伤的可能指标。结论:运用代谢组学技术分析发现磷酸、酪氨酸、色氨酸、尿素、甘油、磷酰乙醇胺其动态变化具有一定的临床意义,且通过代谢通路富集,多集中在氨基酸及糖类代谢中,尤以支链及芳香族氨基酸的合成及代谢最为突出,为疾病的临床诊疗及基础机制研究提供了证据。
【图文】：

病理变化,肝小叶,结缔组织,肝衰竭

将三组大鼠的肝俎织用ＨＥ及Ｍａｓｓｏｎ染色后，病理片置于光学显微镜下观察，逡逑可见慢加急性肝衰竭的不同阶段的典型病理表现：逡逑正常大鼠的肝脏组织中（图３－１Ａ），肝小叶结构明显，汇管区清晰，胆管细胞逡逑无增生，结缔组织无明显增生；胆汁淤积性肝硬化大鼠，即ＢＤＬ组的肝脏组织中逡逑（图３－１Ｂ１）可见肝组织结构不清，肝小叶被破坏，胆菅细胞大量增生，以及少量逡逑炎细胞浸润，Ｍａｓｓｏｎ染色可见结缔组织明显增生（图３－１Ｂ２）；邋ＡＣＬＦ组大鼠的肝逡逑脏（图３RG见明显的炎症细胞浸润’肝组织出现点灶状坏死，ｆ死灶的ＩＥｔ逡逑细胞结构消失。逡逑Ａ逡逑ｒ—逡逑ｍｍｍｍｍ逡逑ｉｉ逡逑

色谱图,大鼠,进样,可重复性

步的进祥和后续分析。在转化过程中，衍生化条件的稳定性和可重复性对实验起逡逑到了重要影响。因此我们随机挑选了一个样本，在处理过程中制作３份，进样时逡逑随机插入在编好的队列中进样。重叠三个同一组织来源的ＴＩＣ图谱（图３－３Ａ），可逡逑见重叠度良好，没有明显的偏移，证明实验衍生化方法及条件稳定可靠，具有良逡逑好的可重复性。逡逑在ＧＣ－ＭＳ的分析过程中，，机器的稳定性无疑也是最重要的一环，它直接关系逡逑到ＴＩＣ图的质量及后续的分析结果。为验证机器的稳定性，我们将同一个祥本在逡逑不同时间点随机进样三次。重叠三张色谱图（图３－３Ｂ），可见色谱图重叠良好，没逡逑有明显偏移，峰强度类似，局部放大（图３－３Ｃ）可见，对单一峰来说，三次进祥逡逑出峰时间和强度基本相同，证明机器时间稳定性良好，本次实验数据有效可靠。逡逑１４逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.3;R-332

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