SENP1在肺发育过程中的作用及其对AECⅡ分化的影响

发布时间：2020-03-25 04:42

【摘要】：目的通过检测SUMO特异性蛋白酶1(SUMO-specific proteases 1,SENP1)、小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-related modifier-1,SUMO1)在肺发育过程中的表达变化,明确SENP1、SUMO1参与调控肺发育,再进一步通过体外培养Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ),研究AECⅡ分化过程中SENP1表达变化,和抑制SENP1对细胞生长及分化的影响,来探讨SENP1在肺发育过程中的作用。方法实验分为两部分:第一部分,根据大鼠肺发育的不同阶段,于生后1 d、4 d、7 d、14d处死新生大鼠取肺组织,通过HE染色法观察不同时期肺的形态结构变化,用RT-qPCR、Western blot检测SUMO1和SENP1 mRNA及蛋白在肺发育不同时期的表达变化。第二部分,体外培养AECⅡ时,通过加入维甲酸(Retinoic acid,RA)促进细胞分化,并使用细胞免疫荧光法和Western bolt检测肺表面活性蛋白C(Surfactant Protein C,SP-C)、水通道蛋白5(aquaporin,AQP5)表达变化,证明RA促分化的作用;进一步在RA促进AECⅡ分化的基础上,通过siRNA转染法抑制SENP1表达,检测SP-C、AQP5及SUMO1表达变化,研究抑制SENP1对细胞分化的影响;同时通过CCK-8和流式细胞术检测抑制SENP1对AECⅡ增殖、凋亡的影响。结果(1)生后14 d内,SUMO1 mRNA稳定表达(P0.05),生后4 d肺组织中游离SUMO1蛋白表达较生后1 d及7 d均明显升高(P0.05)。进一步检测不同状态SUMO1蛋白的表达发现,生后4 d、14 d,肺组织SUMO1总蛋白表达无明显变化,游离SUMO1表达减少,SUMO1结合蛋白表达增加(P0.05)。而SENP1蛋白及mRNA表达变化与游离SUMO1变化趋势一致(P0.05)。(2)免疫荧光及Western bolt检测RA对AECⅡ分化的影响。免疫荧光结果显示,与同时间点对照组相比较,均表现为RA组SP-C表达比例降低,AQP5表达比例升高,差异有统计学意义(P0.05)。Western bolt结果示,与对照组相比,培养24 h和72 h时,RA组SP-C蛋白表达减少,48 h时SP-C蛋白表达增多,差异有统计学意义(P0.05);各时间点与对照组相比,RA组AQP5表达增多,差异有统计学意义(P0.05);各时间点RA组SENP1表达均较对照组增加,差异有统计学意义(P0.05)。(3)进一步在RA促分化的基础上抑制SENP1表达,与RA+si?NS组相比,SP?C蛋白在培养24 h和48 h时表达增加,差异有统计学意义(P0.05);各时间点RA+si-SENP1组AQP5蛋白表达均较RA+si-NS组降低,差异有统计学意义(P0.05);培养48 h时检测抑制SENP1对蛋白SUMO化的影响,随着SENP1表达被抑制,SUMO1结合蛋白(conjugated SUMO1)表达增多,游离SUMO1(free SUMO1)表达减少,差异有统计学意义(P0.05)。(4)利用siRNA转染抑制SENP1,发现各时间点si-SENP1组细胞增殖水平均较si-NS组降低,差异有统计学意义(P0.05)。各时间点siRNA抑制SENP1表达后,si-SENP1组细胞凋亡率均较si-NS组升高,差异具有统计学意义(P0.05)。结论(1)SENP1在大鼠肺发育的过程中动态表达,且与游离SUMO1表达趋势一致,说明SENP1可能通过影响蛋白SUMO化修饰参与肺发育。(2)体外培养AECⅡ发现SENP1在细胞分化过程中表达增加,进一步验证抑制SENP1对细胞分化的影响,发现SENP1表达降低可使AECⅡ分化受抑,同时SUMO1结合蛋白表达明显增多,表明SENP1可能通过调控蛋白SUMO化修饰影响AECⅡ分化。(3)SENP1通过参与AECⅡ分化、增殖、凋亡在肺发育过程中起作用。
【图文】：

形态变化,不同时期,最高水平,统计学意义

SENP1 在肺发育过程中的作用及其对 AECⅡ分化的影响、14 d 大鼠肺组织 SUMO1 mRNA 相对表达量分别为 1、0.88±0、1.07±0.40，差异无统计学意义(P > 0.05)。生后 14 d 内大鼠肺RNA 表达先升后降，4 d 较 1 d 表达升高并达最高水平，7 d 较 4 d，其生后 1 d、4 d、7 d、14 d mRNA 相对表达值分别为 1、2.36±、0.68±0.10，差异有统计学意义(P < 0.05)；7 d、14 d 维持在一稳无统计学意义(P > 0.05)。见图 1.2。

肺组织,形态变化,不同时期

差异无统计学意义(P > 0.05)。见图 1.2。图 1.1 HE 染色观察肺发育不同时期形态变化（×400）A：生后 1 d B：生后 4 d C：生后 7d D 生后 14dFigure 1.1 Histology of transverse sections of isolated lungs from several stages ofdevelopment. （HE，，×400）
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R332.2

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