新型人源永生化小胶质细胞系HM-SV40体外炎症反应模型的建立及优化研究

发布时间：2020-03-25 18:19

【摘要】：随着我国逐渐步入老龄化社会,一系列老年病(如脑梗塞、脑出血、阿尔茨海默病、帕金森病等)的发病率逐年升高,患者人群也逐渐扩大。无论是脑卒中类的急性脑损伤还是阿尔茨海默病这类的慢性神经退行性疾病损伤,都与中枢神经系统炎症反应的过度(急性损伤)与持续(慢性损伤)激活密不可分。炎症反应是急慢性脑损伤病理生理学特征的重要组成部分。因此,有效调控中枢神经系统炎症反应是开发急慢性脑损伤治疗药物的重要方向。由于血脑屏障的存在,外周循环系统中的固有免疫相关细胞无法有效进入中枢神经系统。故此,胶质细胞,特别是小胶质细胞,成为了中枢神经系统炎症反应的主要参与者。多种鼠源永生化小胶质细胞系(如BV2)在过去很多年都是进行小胶质细胞炎症反应机理的重要研究工具。但近年来,本领域研究者逐渐发现,鼠源小胶质细胞与人小胶质细胞在基因表达谱、炎症反应强度、刺激因子选择性等方面存在显著差异。基于鼠源小胶质细胞的研究亦很难为转化医学产生有价值的候选药物分子。同时,由于人原代胶质细胞的获取困难、干细胞分化小胶质细胞的成本高企,鼠原代小胶质细胞与人源小胶质细胞逐渐变为本领域研究的首选工具。但当前研究方法仍较为粗放,人源小胶质细胞系研究较少,鼠原代小胶质细胞的培养技术已十几年未有更新,难以有效模拟体内状态。鉴于此,本项目的主要研究目的是:1)针对加拿大Abm Goods公司近期推出的新型人永生化小胶质细胞系HM-SV40建立并优化体外培养与炎症反应模型技术;2)将最新细胞培养技术、材料以及最新的多因子检测技术用于优化鼠原代小胶质细胞培养与炎症模型技术。第一部分,建立并优化了新型人源永生化小胶质细胞系HM-SV40的体外炎症模型。首先通过对HM-SV40细胞进行qPCR检测,确定其小胶质细胞特异性生物标记物(如TREM2)的表达;同时,表征结果也显示HM-SV40细胞表达小胶质细胞炎症反应相关的调控(LDLR)与激活(TLR)家族基因。为了建立该细胞系的炎症模型,我们首先采用经典的刺激分子(LPS、Poly(I:C)、PHA)对HM-SV40进行处理,qPCR和ELISA检测结果显示,上述经典的炎症刺激分子均不能成功激活该细胞。而后,我们对HM-SV40的激活条件进行了大量的摸索及优化,通过将鼠小胶质细胞与巨噬细胞炎症反应状态的条件培养基加入到HM-SV40的培养体系中,成功实现了对HM-SV40细胞的激活。借助诸如Luminex多因子液相芯片分析等手段,我们从上述条件培养基中逐渐缩小搜索范围,最终确定了TNF-α与IFN-γ可激活HM-SV40细胞,并从蛋白水平(多因子液相芯片分析)与基因转录组水平(RNA-sequencing)对HM-SV40细胞体外炎症模型进行了全面验证与表征。本部分研究为人源小胶质细胞炎症反应的建立,提供了一个新的思路。第二部分,我们分别采用震摇法和磁珠分选法获得大小鼠原代小胶质细胞,并成功建立炎症模型。经验证,而ApoE拟肽COG1410可显著抑制LPS的作用。进一步地,我们针对原代混合胶质细胞普遍存在的批间稳定性差等问题,对培养基成分、培养环境表面材料等因素进行了系统性优化。结果显示,生长于新的Matrigel材料包被的细胞培养板上的鼠原代胶质细胞,相较于传统方法培养的细胞更大程度的模拟了体内胶质细胞炎症反应的行为,并验证了小胶质细胞-星形胶质细胞间存在显著的协同作用。本部分研究为鼠原代胶质细胞培养与炎症模型研究提供了一套新的更优化的技术方法。第三部分,以经典鼠源永生化小胶质细胞系BV-2炎症模型对目前在美国处于临床二期试验的载脂蛋白E(apoE)模拟多肽CN-105进行了初步研究。研究表明CN-105并不能抑制BV2细胞的炎症反应。第四部分,通过表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance,SPR),测定多种ApoE模拟多肽与LDLR相关受体1(LRP1)的配体结合区(LRP1-CR)的体外结合情况。结果显示,ApoE蛋白、模拟多肽COG1410均可与LRP1结合,但未检测到CN-105与任何LRP1-CR的结合信号。综上所述,本文所述研究主要对新型人源永生化小胶质细胞系HM-SV40与鼠原代胶质细胞的培养与炎症模型技术进行系统性开发与优化,为未来的神经系统体外炎症模型研究提供了一些新的指引。同时通过对ApoE模拟多肽CN-105的细胞学与生物物理学初步研究,对原ApoE模拟多肽假设提出了质疑。
【图文】：

图 1. 小胶质细胞条件培养基制备流程Figure 1. Microglia conditional medium preparation process(2) 分别使用 BV2 和 RAW264.7 制备的 MCM 处理 HM-SV40，，且以正常培养、加入无刺激分子处理的条件培养基处理 HM-SV40 作为对照；考察 LPS 和 Poly(I:C)两种刺激分子制备的 MCM 有无差异，同时考察了不同代数的鼠源细胞制备的MCM 对 HM-SV40 的影响，及不同代数的 HM-SV40 对 MCM 的敏感性有无差异；(3) RNA 提取：参照 RNA 提取试剂盒提取所有样品的总 RNA，并使用超微量紫外分光光度计测量提取 RNA 的浓度；(4) 反转录：通过 RNA 浓度计算反转录 1 μg 需要的 RNA 量，参照反转录试剂盒进行反转录获得 cDNA；(5) qPCR 检测：采用染料法进行 qPCR 检测，以管家基因 RPL27 为内参，检测不同浓度 LPS 处理 HM-SV40 不同时间点样品 IL1α 的 mRNA 转录水平。引物序

HM-SV40鉴定Fig2.IdentificationofHM-SV40PG0F----++SFM--++--LPS-+-+-+
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R741;R-332

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本文编号：2600253