鼠抗人CMG2单克隆抗体的制备及其初步应用

发布时间：2020-03-25 20:42

【摘要】：毛细血管形态发生基因2(capillary morphogenesis gene 2,CMG2),为I型跨膜蛋白,全长形式由489个氨基酸组成(CMG2~(489)),基因定位于4q21。CMG2最初由于其参与毛细血管的发生而被发现,后来被证实为炭疽毒素的第二种受体,故又称为炭疽毒素受体2(anthrax toxin receptor 2,ANTXR2)。尽管CMG2的确切生理功能尚未明了,但业已证明,该基因的突变可引起幼年透明性纤维瘤病(Juvenile Hyaline Fibromatosis)和小儿玻璃样纤维瘤病(Infantile Hyaline Fibromatosis)。近年来,CMG2在肿瘤中的作用已引起关注。本课题组前期研究发现,CMG2在胃癌组织高表达,是一个新的功能性的胃癌干细胞(gastric cancer stem cells,GCSCs)表面标志物,参与胃癌干细胞的干性维持,促进胃癌进展,并能充当胃癌患者独立的预后因子。本研究所另一课题组的研究还发现,CMG2在胶质瘤中高表达,其表达水平与胶质瘤的级别和预后密切相关。这些研究结果表明CMG2在胃癌、胶质瘤等肿瘤的发生发展中发挥重要作用,是潜在的诊断指标和治疗靶点。CMG2在肿瘤中的作用值得深入研究,然而,开展这些研究离不开高特异高亲和力的抗CMG2抗体。至今,国际国内商品化抗CMG2抗体大多为多克隆抗体,只有Abcam公司供应兔抗人CMG2单克隆抗体。因此,开发CMG2单克隆抗体具有良好的基础研究和临床应用前景。研究目的制备高特异性和高亲和力的小鼠抗人CMG2单克隆抗体,并用其建立CMG2表达的免疫印迹、免疫荧光、流式细胞术和免疫组化检测方法,探讨其应用于肿瘤细胞和组织中CMG2表达检测的可行性。主要方法1.重组CMG2胞外段抗原多肽的原核表达与纯化根据CMG2(UniProtKB-P58335)的序列信息及在线表位预测结果,设计抗原多肽,包括CMG2胞外段(CMG2-ex)和优势表位肽,并实现其在原核表达系统中的表达,以镍柱纯化表达产物,BCA法测定蛋白浓度,SDS-PAGE检测纯度。2.小鼠免疫、杂交瘤细胞制备及筛选、腹水制备和单抗纯化选择免疫原性最强的抗原多肽为免疫原,常规免疫小鼠和制备杂交瘤细胞。使用外购的真核表达的CMG2胞外段肽作为筛选原,通过间接ELISA方法筛选目标克隆。常规制备小鼠腹水并经Protein A亲和纯化获得相应抗体。3.抗体特性鉴定以间接ELISA法鉴定抗体亚类和亲和力,抗原竞争性抑制实验鉴定抗体的特异性。4.以候选单抗为一抗的检测方法的建立用候选单抗为一抗,建立免疫印迹法、免疫荧光、流式细胞术及免疫组化方法。5.以候选单抗建立的检测方法的初步应用以已知表达CMG2的胃癌细胞系SGC7901细胞和胃癌原代细胞XN0422作为模型,考察所建立的免疫印迹法、免疫荧光和流式细胞术方法的检测效果。以所建立的免疫组化方法对162例胃癌组织芯片、多器官肿瘤组织芯片和多器官正常组织芯片进行CMG2表达的免疫组织化学检测,考察染色的特异性和灵敏度。对带有病理参数和随访资料的胃癌样本,统计分析CMG2表达水平与患者临床病理特征的相关性,以及与病人预后的关系。6.候选单抗对胃癌细胞的抑制作用在两种胃癌细胞中加入高低两种浓度的候选抗体,孵育4d,进行细胞计数,分析候选单抗对肿瘤细胞是否具有抑制作用。结果1.通过对CMG2胞外段的表位分析,设计出CMG2-ex(34-318 aa)、CMG2 epitope1(94-139 aa)、CMG2-epitope2(153-200 aa)和CMG2-epitope3(261-306 aa)4个抗原多肽,并实现了其在原核表达系统的表达。经镍柱纯化后的抗原肽纯度均超过90%,浓度均超过2mg/mL,完全满足制备单抗的需要。动物免疫鉴定结果显示,CMG2-ex具有最强的免疫原性而被确定为制备单抗时的免疫原。2.以CMG2-ex为免疫原,以真核表达CMG2胞外段肽为筛选原,共筛选获得3株单克隆抗体,分别命名为2F8、6A7和8F3。特性鉴定显示8F3单抗的特异性和亲和力均显著优于2F8和6A7单抗,且其亚型为IgG1,被确定为候选的目标抗体。3.用8F3单抗建立的免疫印迹、免疫荧光、流式细胞术方法检测CMG2在胃癌细胞系中的表达,结果表明8F3单抗能很好地应用于免疫荧光、流式细胞术检测方法,但不能用于免疫印迹法检测,提示其针对是构象表位。4.以8F3单抗建立的免疫组化方法具有良好的应用效果和临床应用前景。以8F3抗体为一抗检测162例胃癌组织芯片中CMG2的表达,结果显示,染色主要在胞膜和胞浆,无非特异染色。胃癌组织中CMG2表达远高于癌旁组织,且CMG2高表达患者的无病生存期和总生存期均显著短于CMG2低表达者。Cox单因素和多因素分析显示,CMG2表达水平是患者的独立预后因子。这些结果与本课题组前期采用Proteintech公司的CMG2多抗检测结果相一致。此外,用8F3抗体为一抗对人多种正常组织芯片和人多癌种组织芯片的组化检测结果显示,大多数正常组织呈弱阳性或阴性反应,而不同肿瘤组织呈现不同的CMG2表达水平。5.8F3抗体对胃癌细胞无明显的抑制作用,表明8F3不能作为中和阻断抗体所用。结论成功制备出高特异性和高亲和力的8F3鼠抗人CMG2单克隆抗体,能用于CMG2表达的免疫荧光、流式细胞术和免疫组化检测,但不能应用于免疫印迹法检测。
【图文】：

氨基酸序列,B细胞表位,预测结果,数据库

图 2-1 IEDB 数据库 CMG2 胞外区 B 细胞表位预测结果A：蛋白结构 β 转角 B：蛋白表面可及性 C：蛋白柔韧性 D：蛋白质亲疏水性表 2-1 CMG2 重组表达蛋白氨基酸序列NO.StartPositionEndPositionPeptidePeptidLengtCMG2-ex 34 318QEQPSCRRAFDLYFVLDKSGSVANNWIEIYNFVQQLAERFVSPEMRLSFIVFSSQATIILPLTGDRGKISKGLEDLKRVSPVGETYIHEGLKLANEQIQKAGGLKTSSIIIALTDGKLDGLVPSYAEKEAKISRSLGASVYCVGVLDFEQAQLERIADSKEQVFPVKGGFQALKGIINSILAQSCTEILELQPSSVCVGEEFQIVLSGRGFMLGSRNGSVLCTYTVNETYTTSVKPVSVQLNSMLCPAPILNKAGETLDVSVSFNGGKSVISGSLIVTATECSNG285CMG2-epitope1 94 139PLTGDRGKISKGLEDLKRVSPVGETYIHEGLKLA46

产物鉴定,片段,鉴定结果,重组质粒

陆军军医大学硕士学位论文重组蛋白表达质粒的构建基因由南京金斯瑞合成并插入 pUC57 质粒。将收到的质粒转化 DH切后进行 1.0%琼脂糖凝胶电泳，目的片段正确，CMG2-ex、CMG2度分别为 873bp、527bp、545bp 和 527b。对目的片段进行胶回收后载体，构建 CMG2-ex-pET32a、CMG2-epitope1-pET22b、CMG2-epitopitope3-pET22b 重组质粒，转化 DH5α。对提取的扩增质粒进行双酶大小一致的目的片段（图 2-2），重组质粒构建成功。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

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