单抗6H8识别CD147的表位及其抗疟疾机制研究

发布时间：2020-03-26 03:47

【摘要】：疟疾(malaria)是威胁全球公共卫生安全的重要传染病之一。2016年全球共发生2.16亿疟疾病例,死亡44.5万人。在死亡病例中,超过90%为热带和亚热带地区的儿童~([1])。疟疾由蚊子叮咬传播、疟原虫感染引起,已经明确的能够感染人类的四种疟原虫中,恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)引起的临床症状最为严重。恶性疟原虫入侵红细胞相关蛋白的多态性和免疫逃逸机制使得预防疟疾疫苗的研发极具挑战。近年来耐药性疟原虫株和抗杀虫剂蚊子的广泛传播,更使得全球疟疾的防控面临严峻的考验。CD147为一种单次跨膜的糖蛋白,在红细胞表面广泛表达。研究表明,CD147在恶性疟原虫裂殖子入侵红细胞的过程中作为受体发挥了关键的作用,敲除CD147和靶向CD147的抗体均能有效阻止恶性疟原虫的入侵。6H8为本实验室自主研发的靶向CD147的鼠源单克隆抗体,其人源化抗体命名为HP6H8。体外和人源化动物模型的实验表明,6H8对恶性疟原虫感染具有良好的预防和治疗作用,且在急性毒力试验中表现出良好的安全性。利用6H8抗体靶向宿主CD147分子进行疟疾的预防和治疗,能够避免恶性疟原虫的抗药性和化学类药物可能的副作用,具有很好的临床应用前景。然而6H8识别CD147的表位尚未确定,其发挥功能的分子机制也不明确,因此本课题拟利用X射线晶体学的方法解析CD147-6H8抗原抗体复合物的三维结构,为阐明抗体功能机制、抗体的进一步改造和开发具有抗疟疾作用的模拟肽药物奠定结构基础。本课题主要包括三部分工作:第一部分,CD147和6H8抗原抗体复合物的制备。我们利用原核表达系统对密码子优化过的完整的CD147胞外段及其两个Ig结构域分别进行表达,并采用镍柱亲和层析-阴离子交换层析-凝胶排阻层析的策略进行纯化;对6H8抗体进行木瓜蛋白酶酶切后使用阳离子交换层析-凝胶排阻层析进行Fab段的纯化;对6H8抗体Fv段进行三维建模后进行表位预测并结合His Pull Down实验证实6H8抗体识别的区域为CD147的Domain1(CD147D1);最后,分别将CD147胞外段和CD147D1同6H8抗体Fab段孵育后利用凝胶排阻层析制备出纯度大于95%且均一性良好的抗原抗体复合物。第二部分,抗原抗体复合物及单独Fab段的结晶及结构解析。我们对CD147-6H8Fab、CD147D1-6H8Fab和未结合抗原的Fab段分别进行了结晶条件的筛选和优化,利用分子置换法计算相位,最终成功解析了2.6?分辨率的CD147D1-Fab复合物和1.45?分辨率Fab段的晶体结构。两个结构模型的温度因子和立体化学相关参数均处于合理范围,能够用于结构的精细分析。第三部分,晶体结构分析和6H8抗恶性疟疾分子机制初步研究。对复合物的结构分析表明,抗体6H8通过CDR区形成的结合口袋,同CD147的~(60)Val-Val-Leu-Lys-Glu-Asp-Ala-Leu-Pro-Gly-Glu-Phe-Lys~(75)表位产生盐桥、氢键和非氢键相互作用,尤其是抗体CDR-H3带负电的Asp~(H102)同CD147带正电的Lys~(63)形成的具有很强静电吸引力的盐桥,对于6H8抗体和CD147间的高亲和力至关重要;抗原抗体在自由状态和形成复合物后的结构和温度因子比对表明,6H8和CD147相互作用部分关键氨基酸残基侧链在复合物形成时产生了较大位移,提示结合过程中发生了诱导契合。为了探究6H8发挥抗疟功能的可能机制,我们将CD147D1-Fab复合物结构同已经得到解析的CD147-PfRH5的结构进行重叠比对,结果表明6H8抗体并不影响CD147同疟原虫入侵关键蛋白PfRh5的相互作用,利用真核表达的PfRH5同CD147-6H8复合物进行SPR实验进一步证实了此结论。进一步研究发现,人工合成的CD147的表位肽在体外具有抑制恶性疟原虫入侵红细胞的功能,这证明了6H8抗体抑制疟原虫入侵红细胞的机制既不是阻断CD147同其疟原虫配体蛋白PfRh5的相互作用,也非单纯的空间位阻作用,而是很有可能阻断了CD147同其它疟原虫入侵相关的蛋白的结合。
【图文】：

疟原虫,疟疾,危险区,发病率

图 1 2015 年疟疾在全球疟原虫危险区每 1000 人的发病率分布（World Bank, https://ourworldindata.org/malaria）1.2 恶性疟原虫的生活史疟原虫的生活史非常复杂，涉及到人和按蚊体内的不同组织，其完整的生活史如图 2 所示。首先疟原虫的成熟子孢子（sporozoite）在按蚊叮咬人体的过程中被注入血液，并很快入侵肝实质细胞，数天后通过裂体生殖生成数千个裂殖子[7]（mero-zoites），并胀破肝实质细胞释放入血。血液中的裂殖子能够非常迅速地入侵红细胞并开始其红内期的发育：裂殖子在红细胞内先形成早期滋养体，此时其胞质少且中间有空泡形似戒指，因而也称为环形体（ring stage）；环形体进一步发育形成滋养体（trophozoite），其细胞质增多且体积变大，呈现黄褐色的空泡状，并有疟色素颗粒；滋养体进而发育为裂殖体（schizont）并随着细胞质的进一步增大开始进行核分裂和胞质分裂，形成含有 16-32 个裂殖子的成熟裂殖体[8]；裂殖子成熟后在蛋白酶的作用

红细胞,裂殖子,磷酸化,级联反应

空军军医大学博士学位论文酸化而被激活的[31, 32]。例如，AMA1-RON 复合物对裂殖子和红细胞紧密连接的形成和入侵过程中发挥关键作用，研究发现 AMA1 的功能依赖于 PfPKA 催化的胞内段的磷酸化[33]及进一步的磷酸化级联反应[34]。裂殖子入侵过程不仅涉及自身的信号传导，，还能够主动激活红细胞内的信号转导。有研究表明裂殖子能够通过同红细胞表面的受体相互作用诱导红细胞内的磷酸化级联反应，改变细胞膜的可变形性和细胞骨架的重排从而为入侵提供额外动力[35, 36]。例如裂殖子表面的 EBA175 同红细胞表面受体血型糖蛋白 A 相互作用能够增加红细胞骨架的张力，减少细胞膜的弯曲度从而有利于入侵[37]。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

【相似文献】