Cdc14A蛋白在小鼠一细胞期受精卵的表达和定位研究

发布时间：2020-03-28 02:46

【摘要】：目的细胞分裂周期蛋白14A(cell division cycle 14A,Cdc14A)磷酸酶作为高度保守的丝/苏氨酸双特异性磷酸酶家族中的一员,最初是由L.Hartwell在筛查调控出芽酵母细胞周期基因时意外发现并命名~([1])。它在真核生物(从单细胞真菌中的酵母菌到人类)G2期阻滞中发挥着稳定的保守性作用~([2])。Cdc14在G2/M转换时能下调Cdk1的活性,其功能涉及有丝分裂后期的调控及退出有丝分裂和胞质分裂~([1])。对酵母菌及人类骨肉瘤细胞的研究表明,Cdc14作为重要的细胞周期进程调控因子,其表达的缺失不仅会抑制DNA合成,还会阻碍细胞分裂。Cdc14在哺乳动物细胞中表达两种亚型,分别为hCdc14A和hCdc14B~([3])。hCdc14A在间期定位于中心体,具有调节中心体复制的功能,该功能的实现依赖于它与中心体的相互作用~([4,5])。hCdc14B在间期定位在细胞核仁,还有部分定位在中心体和纺锤体,hCdc14B通过直接与微管结合达到保持主轴稳定的作用。综上,hCdc14A与hCdc14B在定位及功能方面存在差异~([6])。此外,hCdc14A在细胞内的表达水平也会对细胞分裂产生影响。过表达时会引起DNA合成期中心体的提前分离、畸形及多极纺锤体的形成;相反,当表达水平下降时可能会导致胞质不分裂~([1])。Cdc14A磷酸酶在小鼠卵母细胞生发泡期定位于细胞核仁,在生发泡破裂后集聚在染色体周围,而在第一次减数分裂的前期(MⅠ)和第二次减数分裂的中期(MⅡ)分散于整个细胞质~([1])。小鼠受精卵是目前与人类较为接近的细胞周期研究模型,对其深入研究将有利于揭示哺乳动物的生殖、发育调控机制。本研究通过应用Real-time PCR技术和Western印迹法确定小鼠一细胞期受精卵四个时相是否存在Cdc14A蛋白,Cdc14A蛋白的mRNA相对表达量在G2/M转换前后有无变化及应用免疫荧光确定Cdc14A蛋白在小鼠一细胞期受精卵细胞内的定位,为今后研究Cdc14A蛋白调控小鼠一细胞期受精卵G2/M转换中的作用奠定了坚实的基础。方法1.小鼠腹腔内注射PMSG、HCG使其超排卵并采集G1、S、G2、M四个时相的小鼠受精卵细胞;2.运用Real-time PCR技术检测小鼠一细胞期受精卵G1、S、G2、M四个时相的Cdc14A mRNA的相对表达量;3.运用Western印迹法检测G1、S、G2、M四个时相Cdc14A蛋白的表达;4.运用间接免疫荧光观察Cdc14A在小鼠一细胞期受精卵中的定位及核酸染色情况。结果1.Real-time PCR显示Cdc14A蛋白在小鼠一细胞期受精卵G、S、G2、M期均有表达,在G1、S期Cdc14A mRNA的相对表达量较低,G2期的表达较G1、S期为高,到M期表达呈降低趋势。2.Western印迹法检测Cdc14A蛋白在小鼠一细胞期受精卵G1、S、G2、M期均有表达,G1、S期的表达较低,G2期的表达增高,M期表达有降低趋势。3.间接免疫荧光观察Cdc14A蛋白在小鼠一细胞期受精卵中的定位,Cdc14A蛋白(红色荧光)在G1、S和G2期定位于细胞核仁,在M期Cdc14A(红色荧光)均匀的分布于细胞质。结论1.Cdc14A蛋白在小鼠一细胞期受精卵G1、S、G2、M期均有表达,G1、S期表达量较低,在G2期表达最高,到M期表达呈降低趋势。2.Cdc14A在小鼠一细胞期受精卵G1、S和G2期定位于核仁,在M期Cdc14A从细胞核中释放并扩散到整个细胞质。
【图文】：

扩增曲线,无差异,小鼠

表 1-1 小鼠一细胞期受精卵四个时相 Cdc14A mRNA 相对表达量G1 S G2 MCdc14A 1.00±0.01 0.87±0.08a3.56±0.01bc1.68±0.08bcda:与 G1 组比较无差异显著（P>0.01）; b:与 G1 组比较差异显著（P<0.01）; c:与 S 组比较差异显著（P<0.01）; d:与 G2 组比较差异显著（P<0.01）。

曲线,曲线,有丝分裂,柱形图

图 2 Cdc14A mRNA 的融解曲线图 3 Cdc14A mRNA 的相对表达量柱形图2．小鼠受精卵在第一次有丝分裂进程各期的 Cdc14A 蛋白表达
【学位授予单位】：内蒙古医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R321.2

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