【摘要】：MicroRNA(miRNA)作为内源性非编码RNA,几乎参与真核生物细胞发育的所有过程。临床上过敏性皮炎、牛皮藓和银屑病等皮肤疾病引起了长时间的瘙痒,不仅严重影响了患者的生活质量,还带来了沉重的经济负担。为了探讨不同的瘙痒症及其发病机制,近年来建立了各种慢性痒的动物模型,如丙酮/乙醚/水(acetone/ether/water,AEW)诱导的皮肤干燥模型和2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB)诱导的过敏性皮炎模型。已有研究表明慢性痒通常伴随着皮肤损伤,进而使得痒觉受体出现持续活化,从而引起神经元敏化,影响炎症因子的释放,而炎症因子会受到miRNA的调控,因此我们推测miRNA可能参与了慢性痒信号的调控。为了研究miRNA与慢性痒形成的关系,本论文利用AEW诱导的皮肤干燥和DNFB诱导的过敏性皮炎两种不同的慢性痒模型系统评价了慢性痒、miRNA和炎症因子之间的关系,并进一步在体外评价其功能性联系。在小鼠上建立AEW诱导的皮肤干燥和DNFB诱导的过敏性皮炎两种慢性痒模型,行为学检测发现AEW或DNFB处理后显著增加了小鼠颈背部的抓挠次数。进一步,从两种慢性痒模型小鼠中分别取出脊髓和颈背部的背根神经节(DRG)组织,以用于检测这些组织中23种中枢神经系统中高表达的miRNA和9种常见的炎症相关的细胞因子的表达情况。实时荧光定量PCR检测结果表明:(1)AEW处理后显著上调了小鼠的脊髓中miR-124-3p和miR-142a-3p的表达;(2)AEW处理后显著下调了小鼠DRG组织中miR-124-3p和miR-142a-3p的表达;(3)DNFB处理后下调了小鼠DRG组织中miR-142a-3p的表达。以上结果说明慢性痒形成后显著影响了miR-142a-3p的表达。此外,对炎症因子的检测发现:(1)AEW处理后显著影响了IL-6、IL-17、IL-10、TNF-α以及CCL2的表达,其中DRG组织中IL-6表达上调至296%;(2)DNFB处理后显著影响了IL-6、IL-13和CCL3的表达,其中IL-6的表达在脊髓中上调至338%,在DRG中上调至630%。说明AEW或DNFB处理后显著上调了IL-6的表达。综上所述,在慢性痒模型DRG组织中miR-142a-3p与IL-6的表达水平变化最为明显,并且二者呈负相关。上述的研究结果提示着miR-142a-3p和IL-6之间可能存在潜在的功能性联系。为了进一步研究miR-142a-3p和IL-6之间是否存在相互作用,本论文利用小胶质细胞瘤BV-2细胞系,对这二者之间的相互作用进行了体外研究和验证。研究结果显示:在经典致炎物质脂多糖(LPS)的诱导下,BV-2细胞中miR-142a-3p的表达水平呈现时间依赖性的下调(0-8 h),而IL-6的表达水平却呈现时间依赖性的上调(0-8h)。通过向BV-2细胞中转染miRNA模拟物(agomir-miR-142a-3p)构建了miR-142a-3p的超表达细胞。在miR-142a-3p的超表达细胞中,酶联免疫吸附法(ELISA)检测发现IL-6表达量在LPS诱导后出现了显著的下调,从而说明miR-142a-3p可能会调控IL-6的表达。随后对miR-142a-3p进行了靶基因预测发现IL-6是miR-142a-3p潜在靶标之一,并用RNA hybrid软件进行了双链自由能分析,结果发现二者极有可能发生相互作用。因此,体外功能性实验结果显示miR-142a-3p可能会直接靶向IL-6基因,影响其表达。综上所述,本研究表明:在慢性痒模型小鼠的DRG组织中miR-142a-3p的表达呈现下调趋势,而IL-6的表达水平出现了显著的上调,进一步的体外研究结果发现miR-142a-3p能直接调控IL-6的表达。因此,我们推测miR-142a-3p可能通过直接作用于IL-6的mRNA,从而间接参与了慢性痒的信号转导过程。该研究有助于揭示慢性痒的发生和发展的分子机制,从而为慢性痒的治疗提供理论依据。
【图文】：
3.1 AEW 慢性痒模型小鼠颈胸段脊髓和 DRG 中 miRNA 和炎症因子的表达3.1.1 AEW 慢性痒模型及其行为学研究正常昆明系小鼠颈背部脱毛后，用乙醚和丙酮混合液连续处理 12 天，每天上午和下午定时处理一次，建立 AEW 皮肤干燥慢性痒模型，对照组按同样的方式用去离子水处理。在第 8 天、第 10 天和第 12 天，观察小鼠颈背部皮肤变化情况，发现 AEW 组小鼠颈背部皮肤表面有白色的皮屑，并伴有干裂现象；而对照组经去离子水处理后，其颈背部皮肤表面无明显的白色皮屑和干裂，表明对照组小鼠未出现皮肤干燥现象。为了评价 AEW 皮肤干燥慢性痒模型对小鼠痒觉行为的影响，分别在处理第 8 天、第 10 天和第 12 天进行行为检测。实验结果如图所示，与对照组相比，AEW 组在第 8 天、第 10 天和第 12 天的抓挠次数出现显著增加（均值分别是 70、72 和 86，P ＜ 0.001），，说明 AEW 慢性痒小鼠模型建模成功。
29图 3-2 AEW诱导的干燥皮肤模型脊髓和 DRG中 miRNA的相对表达量 脊髓和DRG 中对照组（CON）和实验组（AEW）样品数为 5. 数据用均值 标准误表示。*P < 0.05、**P < 0.01和***P < 0.001 表示实验组与其相应的对照组比较后组间差距显著，采用 t 检验进行检测。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R-332;R758.31
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本文编号：2603927
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