TNF-α调控mRNA m6A甲基化影响间充质干细胞向汗腺特异分化的机制研究

发布时间：2020-03-30 21:10

【摘要】：研究目的探究炎症因子TNF-α是否会影响小鼠间充质干细胞(MSCs)向汗腺细胞分化以及从表观遗传学角度揭示其调控机制。研究内容1.TNF-α对小鼠MSCs汗腺向特异分化的影响(1)MSCs来源广、易获取、免疫原性低和具有多向分化潜能,被认为是以干细胞为中心的细胞治疗的理想细胞来源。利用基因编辑技术、与汗腺细胞在基质胶中共培养等方法可以成功的诱导MSCs在体外获得汗腺细胞的表型,这使得未来深度烧伤患者的汗腺功能再生成为可能。为了解决MSCs体外诱导效率低、诱导周期长,同时为了避免基因编辑技术的脱靶效应、传递系统的有效性和安全性、免疫排斥反应、伦理争论以及基质胶力学性质差、不稳定、在体内被吸收过快等问题,我们利用生物打印技术在体外构建类细胞外基质模拟汗腺发生发育的微环境诱导MSCs向汗腺细胞分化。(2)微环境可以影响MSCs的功能,研究证明TNF-α、IL-6等炎症介质会抑制MSCs向骨、软骨及脂肪细胞分化。结合烧伤患者的生理病理状态,为了有效的诱导MSCs在患者创面向汗腺分化,我们在体外模拟炎症微环境并检测TNF-α对MSCs向汗腺细胞分化的影响。2.TNF-α调控小鼠MSCs向汗腺细胞分化的表观遗传机制(1)多能性调控因子Nanog不仅与胚胎干细胞、肿瘤干细胞分化潜能相关,也参与调控MSCs分化过程,研究证明敲低MSCs的Nanog会抑制其增殖以及分化潜能。为了阐明TNF-α影响MSCs向汗腺细胞分化的机制,我们检测了TNF-α对其Nanog表达的影响。(2)N6-甲基腺苷(m6A)是哺乳动物细胞中最常见的一种mRNA内部甲基化修饰,由以甲基化酶METTL3为主的甲基化酶复合物METTL3/METTLL14/WATP和去甲基化酶FTO和ALKBH5共同调控以维持其动态平衡,参与维持机体多种生理功能和病理过程。Nanog已被证明含有m6A修饰,调控Nanog mRNA的m6A水平可以影响其mRNA丰度进而决定胚胎干细胞、肿瘤干细胞的命运。基于这些研究成果以及为了阐明TNF-α调控MSCs表达Nanog的机制,我们首先探究TNF-α对MSCs总RNA m6A水平的影响以及参与调控这种变化的甲基化酶或去甲基化酶。(3)研究发现甲氯灭酸(MA)是FTO的选择性抑制剂,可与FTO竞争结合m6A修饰的核酸而提高细胞总RNA m6A水平。为了验证FTO的去甲基化作用参与调控TNF-α对MSCs Nanog表达及定向分化的影响,我们用MA的乙酯形式MA_2抑制MSCs FTO的去甲基化作用并观察其对MSCs m6A水平、FTO表达、Nanog表达及向汗腺细胞分化的影响。(4)m6A修饰会加速mRNA降解而调控其表达水平。为了进一步揭示TNF-α影响下FTO的去甲基化作用如何调控Nanog表达,我们检测了TNF-α对MSCs Nanog的m6A水平和其半衰期的影响。研究方法1.TNF-α对小鼠MSCs汗腺向特异分化的影响(1)在二维培养、二维培养结合小鼠足部匀浆、以仿生材料为主要成分的类细胞外基质、以仿生材料和小鼠足部真皮匀浆为主要成分的类汗腺细胞外基质四种条件下诱导MSCs向汗腺细胞分化,培养14天后用RT-qPCR方法和免疫荧光方法检测各组细胞表达汗腺细胞标记物的差异。(2)利用生物打印技术构建以仿生材料和小鼠足部真皮匀浆为主要成分的类汗腺细胞外基质诱导MSCs向汗腺细胞分化,分别给与20ng/ml的TNF-α和空白处理,培养14天后,用RT-qPCR方法和免疫荧光方法检测各组细胞表达汗腺细胞标记物的差异。2.TNF-α调控小鼠MSCs向汗腺细胞分化的表观遗传机制(1)在2D培养条件下和3D培养条件下,分别给与MSCs 20ng/ml的TNF-α和空白处理,继续培养6小时后,RT-qPCR方法和Western blot方法检测TNF-α对MSCs表达Nanog的影响。(2)MSCs融合约80%时分别给与20ng/ml的TNF-α和空白处理,继续培养6小时后,免疫荧光检测两组MSCs总RNA的m6A修饰水平的差异。再结合RT-qPCR方法和Western blot方法检测两组细胞中甲基化酶、去甲基化酶表达的差异。(3)用MA2抑制FTO去甲基化作用来验证是否FTO的去甲基化作用在TNF-α调控MSCs分化过程中发挥重要的作用。首先结合免疫荧光方法检测MA2对MSCs总RNA m6A修饰水平的影响。其次利用RT-qPCR方法和Western blot方法检测MA2是否引起FTO在mRNA和蛋白水平的表达发生变化。然后检测了MA2对MSCs Nanog在mRNA和蛋白水平的表达的影响。最后结合RT-qPCR方法和免疫荧光方法验证MSCs在类汗腺细胞外基质中诱导14天后汗腺细胞标记物的表达差异。(4)结合MeRIP-qPCR技术检测TNF-α对MSCs Nanog mRNA的m6A修饰水平影响。其次利用放线菌素D抑制细胞RNA合成,结合RT-qPCR方法验证Nanog mRNA的m6A修饰水平对其半衰期的影响。研究结果1.TNF-α对小鼠MSCs汗腺向特异分化的影响(1)利用生物打印技术在体外构建的以仿生材料、小鼠足部匀浆为主要成分的类汗腺细胞外基质模拟汗腺发生发育的微环境可以诱导MSCs向汗腺细胞分化,在mRNA和蛋白水平表达汗腺细胞标记物。(2)相对与对照组,TNF-α处理组MSCs在同样条件下诱导14天后汗腺细胞标记物的表达明显受到抑制。结果表明炎症因子TNF-α不仅可以抑制MSCs向骨、软骨、脂肪细胞分化,也会抑制其向汗腺细胞分化。2.TNF-α调控小鼠MSCs向汗腺细胞分化的表观遗传机制(1)与对照组相比,TNF-α处理组MSCs Nanog的表达在mRNA和蛋白水平均被抑制,提示TNF-α通过调控Nanog表达影响MSCs分化,这与敲低MSCs的Nanog会抑制其增殖以及分化潜能的理论一致。(2)与对照组相比,MSCs接触TNF-α6小时后总RNA的m6A修饰水平显著提高,去甲基化酶FTO在mRNA和蛋白水平的表达受到抑制,但是两组间甲基化酶METTL3和去甲基化酶ALKBH5基因的表达没有显著差异。综上所述,TNF-α抑制FTO表达导致MSCs总RNA的m6A修饰水平显著提高。(3)与对照组相比,MSCs接触MA2仅6小时后总RNA的m6A修饰水平显著提高。但两组之间FTO在mRNA和蛋白水平的差异没有统计学意义,这与MA2是通过与FTO竞争结合m6A修饰位点而抑制FTO去甲基化作用的理论一致。此外,MA2在mRNA和蛋白水平抑制Nanog的表达,导致MSCs在类汗腺细胞外基质中诱导14天后汗腺细胞标记物的表达明显减少。由此可知,FTO的去甲基化作用在调控MSCs表达Nanog和分化过程中发挥着重要的作用。(4)TNF-α抑制FTO表达提高了MSCs Nanog mRNA的m6A修饰水平导致Nanog mRNA的半衰期明显缩短,这与m6A修饰会加速mRNA降解理论一致。研究结论TNF-α抑制MSCs表达去甲基化酶FTO,导致Nanog mRNA的m6A水平增加,使Nanog mRNA稳定性下降而加速降解,最终表现为MSCs的分化潜能受到抑制。我们的发现首次阐明了m6A修饰在MSCs功能中的重要性,为微环境在转录后水平调控MSCs的多能性提供了新的认识。此外,通过调节m6a修饰维持MSCs分化能力,为干细胞介导的再生医学提供了一个新的治疗靶点。
【图文】：

图 1.1 间充质干细胞在体外类汗腺细胞外基质环境中可以向汗腺细胞分化。图 A.RT-qPCR 方法检测不同条件下间充质干细胞表达汗腺细胞标记物基因的差异。图 B. 免疫荧光方法检测不同条件下间充质干细胞表达汗腺细胞标记物蛋白的差异。1.2.2 TNF-α 对小鼠 MSCs 向汗腺细胞分化的影响为了探究 TNF-α 对对间充质干细胞向汗腺细胞分化的影响，我们通过调控MSCs 细胞外基质中 TNF-α 的浓度，和利用 RT-qPCR 方法和免疫荧光方法检测各组汗腺细胞标志物表达的差异。实验分为 TNF-α 处理组和空白对照组，RT-qPCR 和免疫荧光结果分析，MSCs 在体外构建的类细胞外基质环境中诱导 14 天后，可以获得汗腺细胞表型，在基因和蛋白水平表达汗腺细胞标志物。TNF-α 处理组的 MSCs 在相同的条件下诱导 14 天后汗腺细胞标志物的表达水平显著低于对照组。

图 1.2 炎症介质 TNF-α 抑制间充质干细胞向汗腺细胞分化。图 A. TNF-α 处理 MSCs 示意图。图 B.RT-qPCR 方法检测 TNF-α 对 MSCs 汗腺细胞标记物基因表达的影响。图 B. 免疫荧光方法检测 TNF-α 对 MSCs 汗腺细胞标记物蛋白表达的影响。1.3 讨论1.3.1 小鼠 MSCs 在体外类汗腺细胞外基质环境中可以向汗腺细胞分化在人体的皮肤上大约分布着 330 多万个汗腺，这些汗腺通过排汗功能发挥重要的体温调节作用，维持着机体正常的新陈代谢。然而，汗腺细胞再生能力很弱，汗腺被破坏后不能通过自我修复而恢复原有结构功能。大面积深度烧伤的患者即使因医疗水平发展而幸存下来，因汗腺结构破坏使排汗功能丧失也会严重影响其生活质量，面临着高汗症、热休克等危险。因此，，寻求合适的外源性细胞来替代损伤的汗腺细胞以及恢复汗腺的功能是急需解决的问题。MSCs 具有自我更新和多向分化的能力，在一定的条件诱导下，MSCs 不仅
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R329.2

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本文编号：2608069