DSS诱导UC模型小鼠肠道内环境菌群失衡特征及蒙药嘎日迪散对菌群失衡的调节作用

发布时间：2020-04-01 02:33

【摘要】：目的:溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性,自发性炎症性肠病,病变部位累及直肠及结肠黏膜。UC病变范围广泛、病情反复发作、治疗效果欠佳、癌变可能性大,已被世界卫生组织列为现代难治疾病之一。近年来研究发现环境因素,特别是肠道微生物以及遗传和免疫因素等可能是溃疡性结肠炎发病的关键病理因素,并且越来越多的研究发现肠道菌群失调与溃疡性结肠炎的发生有着密切关系。嘎日迪散是蒙医用于治疗UC的经典方剂,其治疗效果好,复发率低。前期研究发现嘎日迪散对UC模型具有较好的治疗效果,为进一步探讨蒙药嘎日迪散治疗UC的可能作用机制以及UC模型小鼠肠道内环境菌群变化特点,本研究结合现代医学对UC的最新研究进展和最近研究结果,拟以肠道内环境菌群为靶点,采用高通量测序技术结合生物信息学分析研究DSS诱导的UC模型小鼠肠道内环境菌群失衡特征以及嘎日迪散对失衡菌群的调节作用。方法:采用DSS循环自由饮水法复制UC小鼠模型,无菌条件下对小鼠结肠组织进行取材。取材后对空白组、模型组、柳氮磺吡啶组、补脾益肠丸组及嘎日迪散组小鼠结肠外黏液层、内黏液层及肠道内容物菌群进行总DNA提取,之后扩增菌群16SrRNA基因V3+V4区序列并纯化PCR产物,然后进行高通量测序,测序后对OTUs进行聚类、物种注释及多样性分析。通过MetaStat、LefSe、多元方差分析和空间统计学等统计分析方法分析分组样品的物种组成和群落结构差异性。结果:1.通过对空白组和UC模型组结肠内容物菌群分析,得到与UC相关差异菌共141个,对141个差异菌进一步进行贝叶斯因果关系分析,发现与U C存在直接作用关系的菌群共有3种,分别属拟杆菌科S24-7,Anaerotrunc us属,瘤胃球菌科,当UC发生时会引起Anaerotruncus属丰度显著增加,而拟杆菌科S24-7、瘤胃球菌科丰度减少时会促进UC的发生。2.将柳氮磺吡啶组-模型组24个差异OTU与空白组-模型组内容物141个差异OTU进行比对,筛选得到10个共同差异菌,分别属消化链球菌科、罗氏菌属、肉毒杆菌属sensu_stricto_1、毛螺球菌科、瘤胃菌科、海旋菌属、Blautia属、Alistipes_sp._AP11。将以上共同差异菌进行因果关系分析后发现柳氮磺吡啶可直接影响肠道内容物中Alistipes种AP11来发挥对UC的治疗作用,Alistipes种AP11除对UC存在直接影响外,可直接作用于其下游消化链球菌科,而消化链球菌科最终通过其下游毛螺菌科对UC产生间接作用关系。3.将补脾益肠丸组-模型组16个差异OTU与空白组-模型组内容物141个差异OTU进行比对,筛选得到8个共同差异菌,分别属毛螺菌科、Hold emania_filiformis_DSM_12042 种、克里斯滕森菌科、Alistipes_sp._AP11 种。将以上共同差异菌进行因果关系分析后发现补脾益肠丸、共同差异菌及UC三者不存在直接作用关系,即补脾益肠丸对UC模型小鼠肠道内容物菌群具有一定的调节作用,但其对UC治疗作用机制与肠道内容物菌群调节无关。4.将嘎日迪散组-模型组10个差异OTU与空白组-模型组内容物141个差异OTU进行比对,得到5个相同差异OTU,分别属毛螺菌科、Blautia属、Alistipes_sp._AP11种。将以上共同差异菌进行因果关系分析后发现嘎日迪嘎日迪可通过直接影响毛螺菌科细菌来发挥对UC的治疗作用。5.空白组,模型组结肠内容物,外黏液层,内黏液层组间菌群多样性有显著差异,且组间差异大于组内差异;相同分类水平细菌组间丰度存在一定差异。UC与OTU各层丰度多因素logistic回归分析发现有统计学差异O TU主要分布部位为外黏液层,差异OTU注释主要分类为Clostridiales目中的 Lachnospiraceae 科和 Ruminococcaceae 科。6.将柳氮磺吡啶组-模型组外黏液层26个差异OTU与空白组-模型组外黏液层204个差异OTU进行比对,得到9个相同差异OTU,分别属瘤胃球菌属、Erysipelotrichacea 科、Clostridium_sensu_stricto_1 属、毛螺菌科、拟杆菌属、肠杆菌科、Acetatifactor属。将以上共同差异菌进行因果关系分析后发现柳氮磺吡啶、外黏液层差异OTU及UC三者不存在直接作用关系,即柳氮磺吡啶对UC模型小鼠肠道外黏液层菌群具有一定的调节作用,但并未经外黏液层菌群调节途径发挥对UC治疗作用。7.将柳氮磺吡啶组-模型组内黏液层26个差异OTU与空白组-模型组内黏液层110个差异OTU进行比对,得到2个相同差异OTU,分别为梭菌目vadinBB60科、瘤胃菌科。将以上共同差异菌进行因果关系分析后发现柳氮磺吡啶、内黏液层差异OTUs及UC三者不存在直接作用关系,即柳氮磺吡啶对UC模型小鼠肠道内黏液层菌群具有一定的调节作用,但并未经内黏液层菌群调节途径发挥对UC治疗作用。8.将补脾益肠丸组-模型组外黏液层7个差异OTU与空白组-模型组外黏液层204个差异OTU进行比对,得到2个相同差异OTU,分别属毛螺菌科。将以上共同差异菌进行因果关系分析后发现补脾益肠丸、外黏液层差异OTUs及UC三者不存在直接作用关系,即补脾益肠丸对UC模型小鼠肠道外黏液层菌群具有一定的调节作用,但并未经外黏液层菌群调节途径发挥对UC治疗作用。9.将补脾益肠丸组-模型组内黏液层35个差异OTU与空白组-模型组内黏液层110个差异OTU进行比对,得到5个相同差异OTU,分别属毛螺菌科、毛螺菌科bacterium_6-1种、Allobaculum属。将以上共同差异菌进行因果关系分析后发现补脾益肠丸、内黏液层差异OTUs及UC三者不存在直接作用关系,即补脾益肠丸对UC模型小鼠肠道内黏液层菌群具有一定的调节作用,但并未经内黏液层菌群调节途径发挥对UC治疗作用。10.将嘎日迪散组外黏液层37个差异OTU与空白组-模型组外黏液层204个差异OTU进行比对,得到16个相同差异OTU,分别为海旋菌属、毛螺菌科、Eubacterium_desmolans 种、Blautia 属、乳酸菌属、Turicibacter 属、Gastranaerophilales目、罗斯氏菌属、肠杆菌科、链球菌属。将以上共同差异菌进行因果关系分析后发现嘎日迪、外黏液层差异OTUs及UC三者相互作用关系,即嘎日迪散可直接影响外黏液层毛螺菌科细菌来发挥对UC的治疗作用。11.将嘎日迪散组内黏液层58个差异OTU与空白组-模型组内黏液层110个差异OTU进行比对,得到5个相同差异OTU,分别属毛螺菌科、恶臭假单胞菌种、韦荣球菌科Incertae_Sedis属、拟杆菌属。将以上共同差异菌进行因果关系分析后发现嘎日迪散、内黏液层差异OTUs及UC三者不存在直接作用关系,即嘎日迪散对UC模型小鼠肠道内黏液层菌群具有一定的调节作用,但并未经内黏液层菌群调节途径发挥对UC治疗作用。结论:本研究发现UC模型小鼠肠道内容物菌群出现失调现象,失调菌群之间存在一定的相关作用关系,其中与UC有直接作用的细菌为拟杆菌目S24-7 科(Bacteroidales family S24-7)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、An aerotruncus属共3类细菌,与UC有间接作用的细菌有韦荣球菌科、Turici bacter科、拟杆菌属等共141类细菌。拟杆菌目S24-7科细菌和瘤胃球菌科细菌与UC呈负相关,而Anaerotruncus属细菌与UC呈正相关。当给予UC模型小鼠不同药物时,肠道内容物菌群失调有不同程度的调整,也说明UC的发生与肠道菌群失调存在一定相关性。常用的UC治疗药物作用机制虽尚不明确,但其发挥作用的机制可能与调节肠道菌群失衡相关,并且这些药物参与调整的菌群不同,本研究发现给予UC模型小鼠嘎日迪散后,嘎日迪散可通过直接影响毛螺菌科细菌来发挥对UC的治疗作用,并且毛螺菌科细菌属厚壁菌门(Firmicutes),由此推测嘎日迪散可通过调节肠道内厚壁菌门细菌来发挥治疗UC作用,未来需进一步实验验证。在上述研究基础上,本研究对肠道菌群与UC模型小鼠结肠各部位关系进行了探讨,发现肠道内容物菌群变化相较于黏液层并不显著,菌群结构和种类的变化主要集中于结肠外黏液层,关注肠道黏液层之间特别是外黏液层菌群变化特征对于探究炎症性肠病菌群共性特点以及与疾病之间相互关系将具有更为重要的意义。基于该结论,本研究对嘎日迪散对肠道不同结构菌群的调节作用进行了分析,发现嘎日迪散可对肠道黏液层拟杆菌门(Bacter oidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)细菌产生调节作用,并通过对肠道外黏液层毛螺菌科细菌的调节发挥对UC的治疗作用。基于以上研究结果,本研究认为肠道菌群研究仅限于内容物菌群变化并不能完整揭示肠道菌群变化规律,应结合黏液层菌群变化规律共同研究肠道菌群变化特点。嘎日迪散对肠道菌群具有较好的调节作用,但对结肠内容物和外、内黏液层菌群的调节作用并不相同,毛螺菌科细菌可能成为研究嘎日迪散治疗UC机制的重要直接作用靶点。
【学位授予单位】：中央民族大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R29;R-332
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本文编号：2609894