靶向EGFR二聚体界面的单克隆抗体与单链抗体抗瘤活性研究

发布时间：2020-04-01 15:38

【摘要】：表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR、HER1或ErbB1)是酪氨酸激酶Ⅰ型受体家族的一个成员。EGFR的过度表达或突变可导致细胞异常增殖、血管生成、转移和抗凋亡,与肿瘤的发生、发展和预后高度相关,是恶性肿瘤靶向治疗的热门靶点之一。针对该靶点的上市抗体类药物存在临床反应率低下(10-25%)和耐药问题,这可能与EGFR受体胞外区高度易变、与家族其它成员受体间异源二聚化、以及配体的竞争性抑制有关。二聚化是EGFR家族受体活化的必经过程,并且直接参与二聚化的界面是高度保守的区域。因此,我们提出了EGFR二聚体界面靶向策略,意图解决通过这种靶向策略抗体解决由于受体突变和异源二聚化等原因带来的临床反应率低下和耐药问题。本实验室在前期工作中采用来自EGFR二聚体界面直接参与二聚化的β-环多肽制备了靶向EGFR二聚体界面的多肽疫苗和单克隆抗体EGFR dimer 5G9,并初步证明二者可有效抑制EGFR过表达肿瘤细胞的生长。为了进一步评价EGFR二聚体界面靶向策略的可行性,本研究以来自EGFR dimer 5G9的可变区构建了单链抗体EGFR dimer ScFv,观察了二类分子大小不同抗体对不同受体表型肿瘤细胞的体外生长抑制作用、抗受体同源和异源二聚化能力、抗受体磷酸化能力、以及人表皮癌A431移植瘤摸型实验疗效,以期为新型抗EGFR治疗性抗体的研发打下基础。研究内容:1.靶向EGFR二聚体界面的单链抗体EGFR dimer ScFv的构建与高效制备;2.肿瘤细胞受体表型鉴定;3.单克隆抗体与单链抗体体外抑瘤活性观察;4.单克隆抗体与单链抗体抗受体二聚化研究;5.单克隆抗体与单链抗体抗受体磷酸化研究;6.单克隆抗体裸鼠人表皮癌A431移植瘤实验疗效观察。研究方法:1.单链抗体EGFR dimer ScFv的构建、表达与制备通过基因测序的方法得到EGFR dimer 5G9的可变区序列,并用(Gly_4-Ser)_3连接肽将VH和VL连接。引入MF-α信号肽、His-tag和酶切位点,并经过双酶切后连接进表达载体pGAPZα-A。而后,重组质粒电转化进表达宿主毕赤酵母X-33,经高抗性筛选和表达筛选,得到工程菌。工程菌在30℃、180 rpm条件下,摇瓶发酵72 h。发酵上清经硫酸铵沉淀法粗纯抗体,而后通过镍柱精纯抗体,并用G25分子筛置换缓冲液为西妥昔处方溶剂,BCA法测定蛋白浓度,并按照1 mg/mL浓度稀释,分装于无菌西林瓶中,4℃保存,1-2个月。2.肿瘤细胞受体表型鉴定选取人表皮癌A431、人胰腺癌BxPC-3和鼠成纤维细胞NIH-3T3,进行细胞培养。当细胞培养至丰度为80%时,用NP-40裂解液(含10mmol/L PMSF)冰浴裂解细胞30 min。而后涡旋振荡并离心,上清经BCA法半定量后,按照1 mg/mL浓度稀释。而后,加入上样缓冲液,进行8%SDS-PAGE电泳和Western Blotting分析,检测EGFR、HER2和HER3的表达情况。3.单克隆抗体与单链抗体体外抑瘤活性观察选取EGFR/HER2过表达的A431细胞进行培养。当细胞培养至丰度为80%时,消化细胞种于96孔板内,用完全培养基培养24 h。而后,在1.12μmol/L的EGF刺激下,用不同浓度的抗体与A431细胞共孵育,进行无血清培养48 h,并用MTT法检测增殖情况,计算抑制率以观察抗体量效关系。用2.136μmol/L给药浓度,检测抗体在相同条件下,对NIH-3T3和BxPC-3细胞的体外48 h抑制情况。以溶剂为阴性对照,西妥昔为阳性对照。4.单克隆抗体与单链抗体抗受体二聚化研究选取EGFR/HER2过表达的A431和EGFR/HER2/HER3过表达的BxPC-3细胞进行实验。细胞生长至丰度80%后,消化细胞种于6孔板中,用完全培养基培养24 h。而后,对细胞进行血清饥饿24 h。在1.12μmol/L EGF刺激下,用2.136μmol/L抗体与细胞共孵育不同时间(2 h和12 h)。而后,用BS~3交联剂原位耦联二聚体,以固定二聚体。NP-40裂解液(含蛋白酶磷酸酶抑制剂)裂解细胞,涡旋振荡并离心,上清用BCA法进行半定量,浓度稀释至1 mg/mL。进行8%SDS-PAGE电泳和Western Blotting分析,检测同源二聚体和异源二聚体情况,以及磷酸化的同源二聚体和异源二聚体情况。5.单克隆抗体与单链抗体抗受体磷酸化研究选取EGFR/HER2过表达的A431和EGFR/HER2/HER3过表达的BxPC-3细胞进行实验。细胞生长至丰度80%后,消化种于6孔板中,用完全培养基培养24 h。而后,对细胞进行血清饥饿24 h。在1.12μmol/L EGF刺激下,用2.136μmol/L抗体与细胞共孵育不同时间(2 h和12 h)。而后,用NP-40裂解液(含蛋白酶磷酸酶抑制剂)裂解细胞。涡旋振荡并离心,上清用BCA法进行半定量,浓度稀释至1 mg/mL。进行8%SDS-PAGE电泳和Western Blotting分析,检测EGFR、HER2和HER3总蛋白和磷酸化蛋白表达情况。6.单克隆抗体裸鼠人表皮癌A431移植瘤实验疗效观察用A431细胞建立裸鼠移植瘤模型,设阴性对照组(溶剂)、实验组(EGFR dimer 5G9)和阳性对照组(西妥昔),每组各9只。当肿瘤体积达到100 mm~3时,按照25 mg/kg的剂量进行腹腔注射给药,每3天给药1次,共6次。每3天记录1次肿瘤体积和小鼠体重,并绘制成生长曲线。在给药结束后第九天,处死小鼠并对肿瘤组织拍照和称重。研究结果:1.单链抗体EGFR dimer ScFv的构建、表达与制备结果显示,用毕赤酵母X-33高效分泌表达了EGFR dimer ScFv。SDS-PAGE和Western Blotting分析显示,抗体经镍柱纯化在29.0 kDa附近有His标签特异性的目的条带,纯度99.5%。2.肿瘤细胞受体表型鉴定Western Blotting分析显示,NIH-3T3为EGFR/HER2/HER3正常表达或低表达细胞,A431为EGFR/HER2过表达,HER3低表达细胞,BxPC-3为EGFR/HER2/HER3过表达细胞。3.单克隆抗体与单链抗体体外抑瘤活性观察MTT分析结果显示,EGFR dimer 5G9和EGFR dimer ScFv能显著的抑制A431细胞生长,且抑制率呈现剂量依赖。在2.136μmol/L的浓度时,EGFR dimer 5G9和EGFR dimer ScFv的抑制率相近,分别为47.09±0.94%和48.92±0.31%。在2.136μmol/L的抗体浓度下,EGFR dimer 5G9和EGFR dimer ScFv对BxPC-3细胞有显著的抑制作用,抑制率分别为50.17±0.75%和49.06±0.49%。对NIH-3T3细胞的抑制率分别为7.19±0.50%和6.81±0.48%。4.单克隆抗体与单链抗体抗受体二聚化研究Western Blotting分析结果显示,EGFR dimer 5G9和EGFR dimer ScFv分别与细胞共孵育2 h后,均显示两细胞磷酸化的同源和异源二聚体条带未见显著减少;共孵育12 h后,均显示两细胞磷酸化的同源和异源二聚体条带显著减少。5.单克隆抗体与单链抗体抗受体磷酸化研究Western Blotting分析结果显示,EGFR dimer 5G9和EGFR dimer ScFv分别与细胞共孵育2 h后,均显示A431细胞EGFR受体磷酸化条带显著减少,A431细胞HER2磷酸化条带和BxPC-3细胞EGFR,HER2,HER3磷酸化条带未见显著减少;共孵育12 h后,均显示两细胞EGFR、HER2、HER3磷酸化条带显著减少。6.单克隆抗体裸鼠人表皮癌A431移植瘤实验疗效观察在结束实验时,对照组平均肿瘤体积为3082.5±276.1 mm~3,EGFR dimer 5G9组平均肿瘤体积为1726.8±187.6 mm~3。EGFR dimer 5G9组的抑制率为43.98%(P0.01)。从开始接种肿瘤到结束实验,裸鼠体重未出现显著下降,未出现死亡情况。在最终结束实验时,对照组平均肿瘤湿重为2.33±0.08 g,EGFR dimer5G9组平均肿瘤湿重为1.31±0.13 g。与对照组相比,EGFR dimer 5G9组平均肿瘤湿重显著小于对照组(P0.001)。研究结论:1、成功构建了基于单克隆抗体EGFR dimer 5G9的单链抗体,并采用毕赤酵母组成型分泌表达系统建立了高效制备方法。2、靶向EGFR二聚体界面的单克隆抗体和单链抗体均可有效抑制EGFR过表达肿瘤细胞的生长、受体同源与异源二聚化、以及受体磷酸化,且呈现时间积累效应。3、单克隆抗体EGFR dimer 5G9对人表皮癌A431裸鼠移植瘤有显著生长抑制作用。
【图文】：

模型图,二聚化,配体,二聚体

广东药科大学硕士研究生学位论文3图1-1 表皮生长因子受体(EGFR)家族成员的胞外结构和配体诱导二聚化模型[16]由于在进化上 EGFR 二聚体界面区是高度保守的 β-环，将该 β-环作为抗体的靶向位点，就有可能通过抗体的空间障碍作用有效阻止受体的二聚化，且可以大大减少因受体结构易变带来的耐药性。此外，由于 EGFR 二聚体界面非配体结合区，靶向二聚体界面策略区域可以避开配体的竞争，独立阻断或作为传统抗体的第二道屏障来协同阻断生长因子信号的向下传递。因此，我们提出了靶向高度保守的 EGFR 二聚体界面β-环的 EGFR 二聚体界面策略，即通过抗体特异性结合 EGFR 二聚体界面

基因扩增,产物,菌落,博来霉素

GTTGGTGTTTACTACTGTGCTCAAAACTTGGAGTTGCCATTGACTTTCGGTGCTGGTACTAAGTTGGAGTTGAAGCACCACCACCACCACCACTGATCTAGAGAGT图2-1 目的基因MF-α-EGFR dimer ScFv基因扩增产物M: DNAMarker DL2000，1: 扩增产物。Fig2-1 PCR of EGFR dimer ScFv geneM: DNAMaker DL2000, 1: PCR products.2.4.2 重组质粒的构建与转化E.coli DH5α目的基因和表达载体 pGAPZα-A 载体经 XhoⅠ和 XbaⅠ双酶切后，用 T4DNA 连接酶连接，获得重组质粒并命名为 pGAPZα-A-EGFRdimerScFv(图 2-2)。重组质粒转化进 E.coliDH5α 后，涂布在博来霉素抗性的平板上，次日平板上长出的即为转化子(图2-3)。挑取 16 株菌落进行 PCR 鉴定(图 2-4)，，挑取的菌落大部分都含有目的基因，但
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392

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