荚膜在鲍曼不动杆菌感染鼠巨噬细胞中的作用研究

发布时间：2020-04-01 16:24

【摘要】：目的:鲍曼不动杆菌是临床常见耐药菌,多重/泛耐药鲍曼不动杆菌所导致的感染已成为全球关注的重要公共卫生问题,但对于鲍曼不动杆菌毒力机制研究却少见。荚膜是细菌的重要毒力因子,可以发挥保护细菌并抵抗宿主免疫细胞吞噬清除的功能,但目前尚未见鲍曼不动杆菌荚膜的毒力机制研究。本研究拟通过不同荚膜厚度鲍曼不动杆菌以及提纯的荚膜多糖与鼠巨噬细胞(Raw 264.7细胞)相互作用,探讨鲍曼不动杆菌荚膜诱导鼠巨噬细胞自噬和凋亡机制。方法:1.根据鲍曼不动杆菌和其他不动杆菌16S rRNA基因中特异性序列设计引物,建立多重PCR法鉴定鲍曼不动杆菌和其他不动杆菌。2.采用刚果红染料染色鲍曼不动杆菌,在油镜下观察鲍曼不动杆菌荚膜厚度,建立一种快速简便方法鉴别鲍曼不动杆菌荚膜厚度。挑取两株荚膜厚度差异明显的鲍曼不动杆菌,即厚荚膜株(Ab-H株)和薄荚膜株(Ab-B株)用于后续研究。3.血平板上分别培养Ab-H株和Ab-B株,经37℃培养24 h后收集血平板上菌苔。加入细菌中细菌裂解液,并结合超声裂解细菌,收集裂解后上清加入终浓度为1%三甲基十六烷基溴化铵(CTAB)溶液第一次沉淀荚膜多糖,沉淀以1 mol/L CaCl_2溶液重新溶解,以80%乙醇再次沉淀荚膜多糖,沉淀最终以无水乙醇反复洗涤后即为鲍曼不动杆菌荚膜多糖提取物。所提取荚膜多糖经苯酚-浓硫酸法测定浓度,鲎试剂法检测内毒素含量,并通过LC-MS法分析荚膜多糖成分。4.分别以鲍曼不动杆菌Ab-H株和Ab-B株以及不同浓度纯化荚膜多糖与Raw264.7细胞共培养1 h、3 h和6 h,采用实时荧光定量PCR法检测共培养不同时间Raw 264.7细胞自噬相关基因Atg3、Atg4B、Atg5、Atg7、Atg12、Atg16L1、GABARAPL1和ULK1表达量,采用Western blotting法检测共培养不同时点Raw264.7细胞自噬相关蛋白LC3、Atg12、Beclin-1和凋亡蛋白Cleaved Caspase-3表达量,AnnexinV-FITC/PI法检测共培养不同时点Raw 264.7细胞凋亡率。5.分别以鲍曼不动杆菌Ab-H株和Ab-B株以及不同浓度的纯化荚膜多糖与Raw264.7细胞共培养1 h、3 h和6 h,分别采用实时定量PCR法检测共培养不同时间Raw 264.7细胞TLR2、TLR4、NLRP3和IL-1β基因表达量,流式细胞术检测活性氧(ROS)表达量,Western blotting法检测PI3K、Akt和mTOR磷酸化蛋白表达量,探讨鲍曼不动杆菌荚膜诱导Raw 264.7细胞自噬和凋亡机制。结果:1.经多重PCR法扩增,鲍曼不动杆菌可以获得两条带分别为425bp和208bp;而其他不动杆菌仅有一条为425bp。经基因测序分析208bp条带为鲍曼不动杆菌特异性条带,425bp条带为不动杆菌所共有条带,与预期一致。我院经VITEK 2Compact全自动细菌鉴定系统鉴定醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体中,98%菌种确认为鲍曼不动杆菌。2.鲍曼不动杆菌以刚果红染料染色后,油镜下可见细菌被成紫色,整个背景为淡红色,细菌荚膜不着色,极易辩识。所检测菌株中,细菌荚膜厚度并不相同,挑取两株荚膜厚度差异显著的菌株,即厚荚膜株(Ab-H)和薄荚膜株(Ab-B)用于后续研究。3.本研究中提取鲍曼不动杆菌Ab-H株和Ab-B株荚膜多糖浓度分别为127.593μg/mL和30.047μg/mL,经鲎试剂法检测内毒素含量为0.01 EU/mL,经LC-MS分析两株鲍曼不动杆菌荚膜多糖成分相同。4.鲍曼不动杆菌Ab-H株和Ab-B株,以及纯化的荚膜多糖均可以诱导Raw 264.7细胞自噬和凋亡。鲍曼不动杆菌与Raw 264.7细胞共培养后,细胞LC3Ⅱ和Beclin-1蛋白表达量持续升高,且Ab-H组升高趋势高于Ab-B组(p0.01),Raw 264.7细胞凋亡趋势与细胞自噬相同;纯化荚膜也可以诱导Raw 264.7细胞自噬和凋亡,且诱导的自噬和凋亡强度与荚膜多糖浓度成正比。5.鲍曼不动杆菌和荚膜多糖均可以诱导Raw 264.7细胞表达活性氧,Ab-H组活性氧表达量高于Ab-B组(p0.01),荚膜多糖诱导Raw 264.7细胞表达活性氧能与浓度成正相关。6.鲍曼不动杆菌和荚膜多糖均可以抑制Raw 264.7细胞PI3K、Akt和mTOR蛋白磷酸化,Ab-B组Raw 264.7细胞磷酸化蛋白pPI3K、pAkt和pmTOR蛋白表达量高于Ab-H组(p0.01);荚膜多糖诱导Raw 264.7细胞磷酸化蛋白pPI3K、pAkt和pmTOR蛋白表达量与浓度成负相关。结论:鲍曼不动杆菌及其荚膜均能诱导Raw 264.7细胞自噬和凋亡,荚膜是诱导Raw 264.7细胞自噬和凋亡的重要毒力因子,其诱导能力与其浓度成正相关。鲍曼不动杆菌诱导Raw 264.7细胞自噬和凋亡可能是荚膜诱导Raw 264.7细胞产生大量活性氧并抑制PI3K-Akt-mTOR信号通路,最终引起Raw 264.7细胞自噬和凋亡。
【图文】：

图 2.4.1 不动杆菌/鲍曼不动杆菌鉴定entification of Acinetobacter and Acinetobacarker、1-不动杆菌、2-鲍曼不动杆菌、3膜多糖染色结果膜多糖经过刚果红染色后，整个背景色，而其周围荚膜则会因为不着色呈膜厚度不同（见图 2.4.2）。

图 2.4.1 不动杆菌/鲍曼不动杆菌鉴定Fig 2.4 .1 Identification of Acinetobacter and Acinetobacter BaumanniiM-DNA Marker、1-不动杆菌、2-鲍曼不动杆菌、3-空白对照 鲍曼不动杆菌荚膜多糖染色结果曼不动杆菌荚膜多糖经过刚果红染色后，整个背景会被染成淡淡体会被染成紫色，而其周围荚膜则会因为不着色呈无色透明状，，并菌体周围的荚膜厚度不同（见图 2.4.2）。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392

【参考文献】

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1 钱雪琴;范小勇;蒋晓飞;;墨汁染色在肺泡灌洗液隐球菌检测中的应用[J];中国卫生检验杂志;2014年15期

2 刘丹;王培昌;赵霞;王力红;张京丽;白淑媛;张丽丽;王育英;张红艳;;RAPD、ERIC-PCR联合REP-PCR对多重耐药鲍曼不动杆菌基因型的鉴定[J];山东医药;2010年40期

本文编号：2610691