BCL11A识别γ-珠蛋白基因启动子的结构基础以及BAF180与核小体互作的结构与功能研究

发布时间：2020-04-02 02:33

【摘要】：本论文主要分两个章节,第一章节重点研究了锌指蛋白BCL11A负调控Y-珠蛋白表达的分子机制;第二章节主要研究了人源BAF180蛋白质第一个BAH结构域的晶体结构以及其与核小体的相互作用。第一章节:血红蛋白的主要作用是将氧气运输到身体的各个组织和器官,来维持人类正常的生命活动。血红蛋白由两条α类型和两条β类型的亚基组成,其编码基因分别位于人类第16号和11号染色体上。β类型的亚基由5个不同的珠蛋白基因(ε-,Gγ-,Aγ-,δ-,和β-珠蛋白)编码,并且在胚胎发育过程中会经过两次发育转换。在胚胎期,主要表达ε-珠蛋白;胎儿期,主要表达γ-珠蛋白;成人期,主要表达β-珠蛋白和δ-珠蛋白。此时,胎儿血红蛋白(HbF或者α2 γ2)的水平降到1%以下。β-血红蛋白疾病是由于编码β-珠蛋白的基因发生突变导致β-珠蛋白的结构发生异常或合成异常,包括镰刀型贫血症和β-地中海贫血症。目前,β-血红蛋白疾病治疗方案有羟基脲(hydroxyurea)治疗、输血治疗、骨髓移植和基因治疗。患有“遗传性胎儿血红蛋白持续存在症(HPFH综合症)”的病人没有完成正常的珠蛋白转换,因此血液中仍然含有一定比例的胎儿血红蛋白。对于正常人来说,这种HPFH综合症对他们的健康状况没有显著影响,但是对于患有β-血红蛋白疾病的患者,却能够极大地缓解他们的症状。因此重激活Y-珠蛋白的表达可以作为一种治疗β-血红蛋白疾病的策略。全基因组关联分析研究(GWAS)发现转录因子BCL11A在调控γ-珠蛋白表达上起着重要的作用。在人类造血干/祖细胞CD34+细胞中敲除BCL11A,γ-珠蛋白表达明显上升;在患有镰刀型贫血症的小鼠中,通过条件型敲除BCL11A的表达,可以提高小鼠体内Y-珠蛋白的产量,也可以修正小鼠的表型。尽管大量的功能实验已经证实BCL11A可以调控γ-珠蛋白的表达,但是具体的分子机制仍然还不清楚。直到最近,两个课题组同时报道BCL11A通过其C端的三个串联的C2H2锌指结合γ-珠蛋白基因启动子上游的115bp区域。巧合的是,天然突变G-117A以及C-1 14A/T/G位于该区域内并且被鉴定存在于患有HPFH综合症的病人体内,但是这些天然突变对于负调控γ-珠蛋白的表达机制也还不清楚。我们通过体外克隆表达以及纯化获得了 BCL11A的C端三个串联的锌指Znf4-6,并设计不同长度的DNA序列用于后续的结晶实验,最终获得了 2.50 A的BCL11A和12bp的DNA复合物晶体结构。通过结构分析以及ITC滴定实验,我们验证了 G-117A和C-114A/T/G突变能够极大地减弱了 BCL11A和DNA的亲和力,这与晶体结构中Znf4-5与G-117以及G-114之间存在相互作用一致。我们也通过ITC实验验证了 ZBTB7A蛋白的C端四个串联的锌指可以结合在γ-珠蛋白基因启动子上游200bp区域,亲和力约为120 nM,该区域内也存在一些与HPFH综合症相关的点突变,目前正在进行后续研究。第二章节:染色质重塑作为表观遗传调控的重要组成成分,主要依赖于染色质重塑复合物来实现功能,主要包括SWI/SNF蛋白家族、ISWI蛋白家族、CHD蛋白家族和INO80蛋白家族。在人类细胞中,SWI/SNF家族又可以分为BAF和PBAF两个蛋白质亚家族。BAF180是PBAF亚家族中独有的亚基,在维持基因组稳定、促进哺乳动物心腔成熟、DNA转录过程中的损伤修复以及抑制乳腺癌、肾细胞癌等起着重要的作用。BAF180含有6个Bromo结构域、2个BAH结构域和1个HMG box结构域。其中它的6个Bromo结构域已经被解析,而C末端的HMG box结构域的功能主要是参与结合DNA,但是关于BAH结构域的结构以及功能尚未有文章报道。之前文章报道BAH结构域可以参与识别组蛋白翻译后修饰来调控基因的表达;也可以参与结合核小体来调控基因沉默;也可以参与蛋白-蛋白相互作用。因此探究BAF180的BAH结构域的结构与功能对于理解BAF180的生物学功能具有很重要的意义。我们解析了 BAF180的第一个BAH结构域的晶体结构,并通过体外组装核小体,利用GST pull-down、EMSA以及ITC实验证实了 BAH结构域可以直接结合体外组装的核小体,也能与293T细胞中提取的核小体相互作用。通过大量的点突变实验和核磁滴定实验,我们初步鉴定了 BAH结构域与核小体相互作用的界面信息。我们希望通过后续的核磁滴定实验,能够获得核小体上的作用界面信息,从而搭建结构模型,获得BAH结构域与核小体的三维结构。
【图文】：

邋血红蛋白转换（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ邋ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）逡逑编码ａ类型的珠蛋白基因位于人类第１６号染色体的同一个基因座上，ａ－珠蛋白，其中ａ－珠蛋白基因在每条染色体上有两个拷贝，它们的表达端调控序列（ｌｏｃｕｓ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｒｅｇｉｏｎ，邋ＬＣＲ）所调控。编码Ｐ类型的珠蛋白人类第１１号染色体的同一个基因座上，包含ｓ－，ＧＹ－，ＡＹ＿，邋＆和Ｐ－珠蛋、－和珠蛋白是Ｙ－珠蛋白基因的两个拷贝，它们的主要差别在于丫－因的第１３６位氨基酸上的差异，ＡＹ－珠蛋白基因的第１３６位氨基酸是丙氨ｙ－珠蛋白是甘氨酸，它们的表达同样受５’端调控序列所调控（Ｂｌｏｂｅｌｅｔａｌ．，２ｅｒｔ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１８）。编码ｃｔ类型和Ｐ类型的珠蛋白基因在发育过程中受到录调控，其中Ｐ类型的珠蛋白需要经历两次发育转换，该过程被称为血换（图１．１．２）。在怀孕早期（胚胎时期），血红蛋白主要由＆和ｓ－珠蛋白２），此时珠蛋白在卵黄囊中合成；怀孕三个月至出生前（胎儿时期），主要由ａ－和ｙ－珠蛋白组成（ｃｔ２Ｙ２），此时珠蛋白在胚胎肝中合成；出生后

．，２０１１；邋Ｌｏｈａｎｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１８；邋Ｓａｎｋａｒａｎ邋ａｎｄ邋Ｎａｔｈａｎ，邋２０１０；邋Ｓａｎｋａｒａｎ邋ａｎｄ邋ｉｎｊａｍｕｒｅｔａｌ．，２０１８；Ｗｉｅｎｅｒｔｅｔａｌ．，２０１８）。ｙ－珠蛋白和邋ｐ－珠蛋白的氨间结构都非常的相似，都是由１４６个氨基酸组成。但是编码丫－珠蛋３位氨基酸是丝氨酸，而在Ｐ－珠蛋白基因的相应位置是组氨酸。这－珠蛋白与结合在血红蛋白上的２，３－二磷酸甘油酸（２，３－１）＿１１（＾ｔｅ，ＢＰＧ）分子结合部位的正电荷减少，也即降低了邋ｙ－珠蛋白对２，３－的亲和力。２，３－二磷酸甘油酸是血红蛋白的一个重要的别构效应物，白可以结合一分子的２，３－二磷酸甘油酸。２，３－二磷酸甘油酸是一个子，，能够与Ｐ－珠蛋白的第８２位赖氨酸、第２位的组氨酸、第１４３第１位缬氨酸的Ｎ末端的正电荷存在静电相互作用而被锚定在血成的空穴中。结合了邋２，３－二磷酸甘油酸的血红蛋白对氧气亲和力要下要低，因此胎儿时期的血红蛋白载氧能力要比成人时期的血红蛋能维持胎儿在母亲体内能够获得足够的氧气维持自己的生存需求。，他们能够自主进行呼吸，所以不再需要从母亲那里获取氧气来满所以胎儿血红蛋白ＨｂＦ需要降低到很低的水平。逡逑｜Ａ｜逦ＨＳ－４０逦？？逦ａ２邋ａ＿ｌ逦ａ－ａｌｏｂｉｎ邋ｌｏｃｕｓ逡逑＇＂
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R341

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本文编号：2611322