用单分子磁镊研究G-四链体配体与双链DNA结合的特性

发布时间：2020-04-02 18:16

【摘要】：背景:癌细胞的无限增殖需要基因组的快速复制和转录,因此靶向生物大分子核酸的化疗药物的治疗方法是对抗癌症的重要手段。除了靶向双链DNA外,近年来,靶向基因组G-四链体核酸的小分子配体受到广泛的关注。在基因组中,形成G-四链体的核酸序列在癌基因启动子区域和端粒区域富集。靶向G-四链体的小分子化合物通过下调癌基因的转录和抑制端粒酶的表达从而发挥抗肿瘤作用。大多数G-四链体配体具有多芳香平面环结构,G-四链体结构与配体通过π-π堆积等相互作用而被稳定从而阻碍基因复制并导致双链DNA断裂。由于G-四链体配体的平面环结构与带正电荷基团的因素,部分配体与双链DNA具有一定的亲和力。针对G-四链体配体是通过稳定G-四链体或是嵌入双链DNA中发挥抗癌作用仍存在争议。目的:此前有文献报道配体与双链DNA有作用,但传统生化方法检测药物和DNA结合的灵敏度有限。另外配体与双链DNA结合的模式和结合位点数尚不清楚,影响了对配体与双链DNA作用的系统性理解。因此对G-四链体配体与双链DNA的作用的研究有助于阐明配体对于双链DNA的影响及寻找和设计选择性好的G-四链体配体提供数据支持。方法:首先,我们以lamdba-DNA为模板通过PCR的方法扩增出5’末端分别修饰生物素和巯基的6618 bp双链DNA,将PCR产物纯化回收,并通过化学修饰将双链DNA连与玻璃表面与超顺磁球之间,进行双链DNA单分子拉伸实验研究。其次,我们利用磁铁产生的梯度磁力进行单分子双链DNA拉伸操作。通过记录受不同恒力下的磁球高度确定双链DNA的拉伸长度变化,以进行对双链DNA在受力后力谱的研究。在不同恒力下,加入配体后记录DNA的伸长高度,依据DNA的伸长以判别该配体与双链DNA可能的结合方式,通过希尔函数拟合得到配体与双链DNA作用的解离常数(K_d),并计算单分子配体嵌入DNA后导致DNA的伸长量((35)x),以及计算结合双链DNA的相邻两配体分子间隔的碱基数(n)等信息。结果:将吖啶类G-四链体配体BRACO-19、RHPS4、杂环类CX-5461以及卟啉类TMPyP4与双链DNA结合的力-拉伸和浓度-伸长曲线与EB的相比,我们发现CX-5461结合双链DNA后DNA的伸长量大于EB,其他配体与EB相似。另外我们定量分析出了以上四个配体与双链DNA的解离常数(K_d),范围在0.59?M-2 uM之间。配体BRACO-19、RHPS4、CX-5461和TMPyP4与双链DNA有较强的嵌入结合,这一结果与此前报道一致,其中相邻两配体分子结合双链DNA之间的距离为1.9-3.1个碱基之间。另外,卟啉类配体NMM、喹啉类配体PDS、Phen-DC3及喹嗪类配体TrisQ与双链DNA结合导致的DNA的伸长量低于EB,其中NMM在低浓度(1,4,8,80?M)几乎不与双链DNA结合。并且Phen-DC3和TrisQ分子在一定的拉力下需间隔3个以上的碱基才能与双链DNA结合。我们分析得到了八个G-四链体配体在双链DNA上的结合数量,其中NMM、PDS、Phen-DC3和TrisQ在双链DNA的结合数目较少,其他配体与EB接近。这一结果表明Phen-DC3和TrisQ是选择性较好的G-四链体配体。结论:综上我们发现配体CX-5461、BRACO-19、RHPS4和TMPyP4与双链DNA发生较强的嵌入结合;NMM、PDS、Phen-DC3和TrisQ与双链DNA结合相对弱些,是选择性较好的G-四链体小分子化合物。
【图文】：

细胞白血病及成年人和儿童的急性淋巴细胞白血病[11]。阿霉素治疗包括急性淋巴细胞白血病、神经母细胞瘤、乳腺癌、卵巢1]。米托蒽醌与其他抗癌药物联用可治疗成年人的急性非淋巴细吖啶可治疗成年人的急性白血病和恶性淋巴瘤，但是在实体瘤 DNA 的药物是临床上治疗肿瘤的有效制剂，并且与其他不同合使用时明显提高患者的存活率，但是由于其的毒副作用和药其临床使用，上述 4 种抗肿瘤蒽环化合物会导致心脏毒性，最致死亡[2]。该类靶向 DNA 的药物在发挥药效时不仅与肿瘤细与非病变细胞的 DNA 反应，从而产生药物的毒副作用。因此 DNA 并且毒性小的药物是人们不懈研究的目标。研究发现生殊构型的 DNA-G-四链体，该构型的 DNA 与癌症和艾滋病等关系。

2 G-四链体核酸结构双链 DNA（B-DNA）是经过碱基互补配对形成右手螺旋的 DNA 二级，，具有弹性和柔韧性的 B-DNA 储存并传递遗传信息。然而，在 20 世纪 5后期，人们发现了不同于 B-DNA 二级构型的 DNA，到目前为止，已发现 种不同的 DNA 构象，如左手螺旋 Z-DNA，发卡构型 DNA, 滑动结构 Dotif，三重结构 DNA 和 G-四链体[15]。 每种构型 DNA 都有各自独特的生义。其中 G-四链体核酸是最近几十年人们研究的一个焦点。G-四链体是鸟嘌呤（G）的真核生物 DNA 或 RNA 单链通过 8 个 hoogsteen 氢键组成 体，然后有至少两个 G-四分体堆叠而成为特殊的 G-四链体核酸二级结构证实 G-四链体 DNA 能被单价正离子如 K+,Na+稳定[16]。依据形成 G-四A 链的数量，G-四链体 DNA 可折叠为分子间四分子 G-四链体，分子间 G-四链体，分子内 G-四链体[17]。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R394

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本文编号：2612281