上调p21和下调MTH 1基因表达对裸鼠HepG 2肝癌的抑制作用

发布时间：2020-04-03 17:11

【摘要】：目的:本实验通过RNAa和RNAi技术在裸鼠肝癌HepG 2肿瘤模型上,通过上调p21基因表达,下调MTH 1基因表达,在动物整体水平研究对肝癌HepG 2肿瘤的抑制作用,为肝癌治疗提供新的治疗策略。方法:首先在体外培养肝癌HepG 2细胞,当HepG 2细胞生长到对数生长期时,将HepG2肿瘤细胞注射在裸鼠右前肢腋下以建立种植瘤裸鼠动物模型。将荷瘤成功的裸鼠随机分为4组:对照组(CT)、saRNA-p21转染组(P21)、siRNA-MTH 1转染组(MTH1)和双转染联合组(P21+MTH 1),每组6只。肿瘤动物模型建立成功后在瘤旁注射给药,三天一次,每鼠每次19.8μg,持续给药30天。给药期间观察各组裸鼠的生活状况、肿瘤体积变化以及生存时间。给药结束后,取下肿瘤组织进行脱水包埋,制备成冰冻切片。通过HE染色法观察各组肿瘤组织中肿瘤细胞的病理形态,实时荧光定量PCR技术检测各组p21和MTH 1基因mRNA的相对表达情况;免疫荧光方法检测各组肿瘤组织中P21、MTH 1蛋白的表达;Western blot和ELISA方法检测各组肿瘤组织中P21、MTH 1以及凋亡相关蛋白Bak、Caspase-3的相对表达水平;同时建立裸鼠肝癌HepG 2肿瘤模型进行RNAs与顺铂药的药效对比研究,将荷瘤成功的裸鼠随机分为3组:对照组(CT)、双转染组(P21+MTH 1)、顺铂组,每组6只。肿瘤动物模型建立成功后在瘤旁注射给药,三天一次,RNAs和顺铂药每鼠每次40μg,持续给药30天。给药期间观察各组裸鼠的生活状况、肿瘤体积变化以及生存时间。结果:肝癌HepG 2肿瘤裸鼠动物模型成功建立,成瘤率均为100%,裸鼠的生存率为100%;肿瘤体积增长曲线结果显示,P21组、MTH 1组肿瘤体积增长速度低于CT组,P21+MTH 1组差异更为显著;qPCR和WB结果显示,体内转染靶向p21基因的saRNA和靶向MTH 1基因的siRNA后,转染组相比对照组,p21的mRNA水平和蛋白水平显著升高,MTH 1的mRNA水平和蛋白水平显著降低,联合转染组差异更为显著。ELISA结果显示,联合双转染组肿瘤组织中Bak蛋白表达量增加,而单转染组则无明显变化。另外,Caspase-3蛋白在转染RNAs的实验组中表达均有所升高,且双转染组表达量明显高于单转染组。药效实验的肿瘤体积增长曲线结果显示,相对于对照组,顺铂组与双转染组对肿瘤体积增长有类似的抑制作用,且双转染组小鼠存活率远远高于顺铂组。结论:上调p21基因和下调MTH 1基因表达可有效抑制HepG 2肿瘤的生长。p21和MTH 1基因表达的共同调节作用比仅调节MTH 1或p21基因表达时抑制效果更为显著。此外,siRNA靶向p21基因与saRNA靶向MTH 1基因的联合调控可诱导HepG 2细胞凋亡,其机制有可能与Bak/Bcl-xl凋亡途径中Bak的表达升高有关。且联合调控癌基因表达效果优于单一调控。药效对比实验结果表明,在治疗过程中RNAs药物与顺铂药物相比治疗效果类似,但对机体所产生的的毒副作用远远小得多。
【图文】：

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3.1 荷瘤小鼠一般生理情况观察裸鼠在接种 HepG 2 细胞后生存状况良好，饮食正常，6 天后所有小鼠块，测量肿瘤体积后均达到成瘤标准（>100 mm3），成瘤率 100%，组间无显随着实验的进行，，单转染 saRNA-p21/siRNA-MTH 1 组小鼠肿瘤的生长速度转染 saRNA-p21+siRNA-MTH 1 组小鼠肿瘤的生长速度与对照组相比更为缓后期，对照组小鼠逐渐出现食欲不振、精神下降、活动异常等现象。3.2 siRNA 和 saRNA 给药对小鼠肿瘤体积、质量和生存率的影响给药 30 天后对比各组裸鼠肿瘤的体积大小、重量以及生长速度。转染大小明显小于对照组，双转染组差异更为显著（图 1 A）。转染组裸鼠肿瘤比对照组明显降低，双转染组差异更为显著（图 1 B）。转染组肿瘤重量明组，双转染组差异更为显著（图 1 C）。对照组的肿瘤体积及肿瘤重量与转存在明显的差异，具有统计学意义(P<0.05)。其中 saRNA-p21+siRNA-MTH的效果尤为明显。结果如下图所示：

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青岛大学*士学位论文Fig. 1 A contrast image of tumor size, B contrast image of tumor growth rate and C ctumor weight after dissection.The results showed that RNAs could significantly inhibit tHepG 2 tumors in nude mice.3.3 HE 染色法观察肿瘤组织的细胞形态分析 HE 染色结果得出，转染组与对照组相比，肿瘤组织内肿瘤细严重，双转染组与对照组相比更为严重。如图 2 所示：图 2
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R735.7;R-332

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