云南省大理州片形吸虫分子鉴定及遗传多态性分析

发布时间：2020-04-05 00:59

【摘要】：目的:本研究旨在利用分子生物学方法鉴定大理州地区片形吸虫的种类,分析其遗传多样性,验证是否存在杂合型片形吸虫及其杂合程度,在一定程度上丰富该地区片形吸虫分类的科学依据。深入探讨大理片形吸虫的种内差异、种间差异和亲缘关系,寻找优势种,为今后大理地区制定片形吸虫病的防治策略,改进防治措施提供理论基础,以保护人群健康并降低经济损失。本研究选用了多个分子标记,方便与前人的研究进行对比,明确大理地区片形吸虫遗传多态性与其他地域间的差异,同时探讨不同分子标记的应用潜力。方法:从大理州下关农贸市场采集到9头感染片形吸虫的黄牛肝脏,从中分离获得122条片形吸虫成虫,并孵育获得其虫卵。分别提取122条片形吸虫成虫及其虫卵的基因组DNA,PCR扩增核糖体ITS+序列,线粒体COX I和NAD I序列进行扩增并测序,所得序列经BLAST在线工具进行比对,进行同源性分析;并结合pepck基因的多重PCR结果判定虫种。应用BioEdit软件对测序结果进行多重比对,进一步分析122条片形吸虫亲代及子一代的遗传变异。ITS+测序图谱中特定杂合位点等位基因的峰高比值即杂合体携带肝片形吸虫和巨片形吸虫基因的比例,据此推测不同个体的杂合程度。另收集广西南宁的巨片形吸虫作为对照虫种与之进行比较。结果:ITS+全长945/946bp,出现11个变异位点,122条采自大理的片形吸虫,7条为肝片形吸虫(5.74%),115条为杂合型片形吸虫(94.26%),其中杂合型片形吸虫在序列图谱中11个变异位点出现双峰,个体间双峰比值存在明显差异,提示其携带巨片形吸虫与肝片形吸虫基因的比例不同,从Fg:Fh≥10:1到Fg:Fh≤1:10不等。NAD I全长535bp,共出现48处变异位点,1条(0.82%)NAD I序列与肝片形吸虫相同,121条(99.18%)与巨片形吸虫高度同源,121条中有116条碱基序列完全一致,其余5条各存在单个碱基的突变。COXI全长438bp,共有42处变异位点,122条片形吸虫中,1条(0.82%)COXI序列与肝片形吸虫相同,121条(99.18%)与巨片形吸虫相同,121条中有120条碱基序列完全一致,余1条有1个变异位点。pepck的多重PCR结果显示所有大理地区的片形吸虫样本均可扩增出肝片形吸虫和巨片形吸虫的双重条带,为杂合型片形吸虫。综合ITS+、NADI、COXI序列的测序和pepck的多重PCR结果,122条检测的片形吸虫均为Fg/Fh杂合型片形吸虫。虫卵(子一代)线粒体COXI、NADI序列与母本完全一致;ITS1序列,虫卵与母体的分型完全一致,但其杂合程度存在分化现象。结论:本次试验结果初步认为大理地区的片形吸虫已经高度杂合。NAD I和COX I分子标记结果相似,122条大理片形吸虫样本中仅DL1-10为肝片形吸虫,其余均为巨片形吸虫。由于线粒体按照母系方式遗传,据此可知巨片形吸虫是大理片形吸虫主要的母系来源。ITS序列将大理样本分为肝片形吸虫(7)和杂合型片形吸虫(115)两类,但该序列区段显示为肝片形吸虫的样本(7/122)均被pepck识别为杂合体,因此为了使片形吸虫的分类鉴定结果更为准确可靠,应选取多个标识序列进行分析。本研究中根据不同分子标记中个别碱基的差异,可进一步划分为8个基因亚型,其中,Fsp1基因亚型占89.34%,为大理地区片形吸虫的优势亚型。
【图文】：

逑和ＮＡＤ邋Ｉ的序列特征，对我国１３个省市的２１１条片形吸虫样本进行分类研宄。逡逑结果见图２，乌鲁木齐、西宁、呼和浩特市的样本均为肝片形吸虫，而广州地区逡逑的样本均为巨片形吸虫，在长沙、贵阳和昆明也发现了巨片形吸虫。值得注意的逡逑是，１２３条中国无精型片形吸虫中有１２２条属于杂合型个体，仅１条无精型样本逡逑被鉴定为纯种巨片形吸虫。另一方面，，１１条来自长春、武汉、长沙、昆明的生逡逑精能力正常的片形吸虫也属于杂合型片形吸虫。该结果表明肝片形吸虫和巨片形逡逑吸虫分别分布于中国大陆的北部和南部，杂合型片形吸虫分布广泛，在我国占据逡逑主导地位（６３．０％）。逡逑＿逦；逦－ｉ：邋＇邋Ａ邋Ａ逦、逡逑？ｉｆ逦Ｘｍｉｎｇ逦？逡逑Ｉ、r>｜邋

本文编号：2614308