利用斑马鱼模型研究BRD4基因在髓系造血调控中的作用

发布时间：2020-04-06 12:58

【摘要】：目的:初步分析野生型斑马鱼中brd4基因的时空表达情况。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立的可稳定遗传的brd4基因靶向敲除的斑马鱼突变体来探讨brd4基因在斑马鱼胚胎髓系造血分化中的作用。同时,利用BRD4蛋白的特异性小分子抑制剂JQ1处理野生型斑马鱼胚胎以进一步验证brd4基因的作用,为理解brd4基因在造血发育及调控中的作用提供理论依据。方法:(1)基于斑马鱼brd4 mRNA CDS编码区设计并构建合成反义的RNA探针,运用整胚原位杂交实验技术(WISH)和RT-PCR分析brd4基因在野生型斑马鱼体内的时空表达。(2)通过提取斑马鱼的基因组DNA和RNA、PCR扩增、基因测序和RT-PCR等多种方法鉴定brd4基因敲除斑马鱼突变体。(3)使用小分子抑制剂JQ1处理野生型斑马鱼胚胎,进一步验证brd4在髓系分化中的作用。(4)通过苏丹黑B染色实验检测成熟中性粒细胞的数量和分布。(5)通过中性红活体染色实验检测巨噬细胞的数量和分布。(6)利用整胚原位杂交(WISH)实验检测髓系造血特异性标记基因mpx、lyz、l-plastin、mfap4的时空表达水平。结果:(1)成功构建brd4 mRNA分子探针,brd4基因为母系遗传,早期呈广泛和非特异性地表达;(2)与野生型和杂合突变斑马鱼相比,brd4~(-/-)斑马鱼通常在13dpf左右死亡,存活率的下降表明brd4基因在斑马鱼生长发育方面发挥了关键的作用;(3)通过T7转录酶体外转录cDNA,成功制备了斑马鱼粒系、单核巨噬系分化标记基因的反义RNA探针,且具有良好的特异性;(4)苏丹黑B染色(SBB)检测到brd4~(-/-)的成熟中性粒细胞数量上的显著减少,而中性红活体染色实验检测到brd4~(-/-)的巨噬细胞数目与野生型斑马鱼相比无明显差异;(5)整胚原位杂交(WISH)检测brd4~(-/-)斑马鱼的粒系相关基因mpx、lyz的表达水平与野生型斑马鱼相比明显下调,而单核系基因l-plastin、mfap4的表达水平无明显差异。(6)JQ1小分子抑制剂处理后的WT斑马鱼的表型分析结果与以上结果一致。结论:敲除brd4基因和JQ1药物持续处理后均导致斑马鱼中性粒细胞的分化发育阻滞和数量上的明显减少而不影响单核巨噬细胞的分化发育,提示brd4基因对正常粒细胞造血分化至关重要,其具体详尽的分子调控机制及功能尚需进一步研究。
【图文】：

图 2. 斑马鱼早期发育过程中 brd4 的整胚原位杂交结果：0.75h,3h,4.7h,6h,12h,24h,48h,72h 分别代表斑马鱼单细胞受精后 0.75,3,4.7,6,12,24,48,72 小时后 brd4 的 mRNA 表达图。3.brd4 基因在野生型成年斑马鱼组织器官中的表达分析在研究 brd4 基因在野生型成鱼脏器中的表达情况时，我们通过实时荧光定量 PCR 实验对野生型斑马鱼的 7 个脏器组织进行了检测。结果显示，7 个检测的脏器组织均有 brd4 基因的表达。其中，肌肉和脑的表达最高，脾脏和肾脏的表达最低，其余脏器如心脏、肝脏和卵巢的表达处于中间状态（如图 3 所示）。

年斑马鱼各组织器官中 brd4 基因的表达情况。 基因敲除斑马鱼突变体的敲除有效性分析rd4 基因发生移码突变的斑马鱼品系 M1 的靶位点 DNA 突变情况如接下来，我们将野生型斑马鱼与可导致 brd4 基因阅读框发生改变的成鱼交配，并把得到的 F2 代胚胎饲养至一个月左右时检测基因型代 brd4 杂合子成鱼自交产卵后得到了一批 F3 代斑马鱼。根据孟德，我们预计 F3 代中应该有 1/4 比例的 brd4 敲除型纯合突变体，14 杂合子和 1/4 比例的野生型斑马鱼。然而，对生长至 1 个月时期的剪尾鳍做基因型鉴定后，我们并未筛选到 brd4 基因敲除的纯合突面的实验结果初步证明，与野生型或杂合突变型斑马鱼相比，brd活率下降，且通常在幼鱼期 13dpf 左右时死亡。们首先通过异源双链泳动实验在 DNA 水平上对该突变品系的靶向了验证。电泳结果显示，，以杂合子斑马鱼的基因组 DNA 为模板扩
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R394

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本文编号：2616541