人副流感病毒3型抑制应激颗粒形成的分子机制研究

发布时间：2020-04-06 11:03

【摘要】：人副流感病毒3型(Human Parainfluenza Virus Type 3,HPIV3)属于副粘病毒科,它与我们所熟知的水泡型口炎病毒、呼吸道合胞体病毒、埃博拉病毒、狂犬病毒、麻疹病毒等都属于不分节负义RNA病毒。HPIV3主要通过空气传播,感染呼吸道肺上皮细胞,引起婴幼儿的急性呼吸道疾病,如肺炎、支气管炎等。目前并没有研发出针对HPIV3可用于临床的有效疫苗和抗体,因而对HPIV3分子机制,致病机理等的深入研究对于人类及早攻克这类病毒有着重要意义。病毒感染通常会激活宿主细胞的压力应答反应,例如激活细胞的先天性免疫应答信号通路,诱导细胞形成应激颗粒(Stress Granules,SGs)等。我们的研究发现,HPIV3感染会激活宿主细胞中PKR的自磷酸化,并诱导其下游底物eIF2a的磷酸化。磷酸化的eIF2a无法参与到tRNA的转运循环中,因而导致大量mRNA的翻译无法顺利进行,停止在翻译起始阶段。这些翻译起始被抑制的mRNP复合物在细胞质中大量积累,并逐渐形成SGs。HPIV3感染宿主细胞后开始进行复制转录,一方面表达大量的病毒蛋白,另一方面形成大量的病毒RNA。我们的研究发现这些病毒RNA是其诱导细胞形成SGs的关键因素,病毒RNA被宿主细胞的PKR所识别,并激活PKR/eIF2a的磷酸化,从而诱导细胞形成SGs。通过RNAFish实验我们发现,HPIV3感染诱导细胞形成的SGs可以捕获病毒的mRNA,抑制病毒蛋白的翻译,从而抑制HPIV3的复制与传播。我们通过沉默G3BP的表达来破坏SGs的形成,可以明显增强HPIV3病毒蛋白的表达和病毒的复制。从而证明HPIV3感染诱导宿主细胞形成SGs,并且这种SGs具有抗病毒功能,可以抑制病毒的复制及其病毒蛋白的表达。为了完成自身的复制,不同的病毒通常会进化出各种各样的机制来逃逸宿主的抗病毒应答反应。HPIV3与其它多种NNSRNA病毒一样,感染宿主细胞后会在细胞质中形成一种包涵体(Inclusion Bodies,IBs)结构,通常认为病毒的包涵体是病毒的复制工厂,主要参与完成病毒RNA的复制与转录。除此之外,包涵体也可能参与调控宿主细胞的抗病毒应答反应。我们的研究首次发现HPIV3的包涵体可以参与调控SGs的形成。当我们过表达HPIV3野生型的N和P蛋白时,在细胞中形成大量的包涵体,这些包涵体可以明显抑制HPIV3感染诱导的SGs的形成,然而对AS刺激,pIC和RNA转染诱导的SGs的形成没有明显影响,这表明HPIV3的包涵体可以特异性的抑制其病毒感染诱导细胞形成SGs。N蛋白的478位亮氨酸使其与P形成包涵体的关键位点,当将的点突变NL478A与P共表达时,不再能形成包涵体结构,因而也无法再抑制HPIV3感染诱导细胞形成SGs,这表明HPIV3的包涵体结构对于其抑制SGs的形成至关重要。通过RNAFish实验我们发现,HPIV3野生型的N和P形成包涵体可以很好地结合病毒的RNA,而N的截短突变体NAN10虽然也可以与P形成包涵体,但是其结合病毒RNA的能力明显下降,并且也不再抑制HPIV3感染诱导的SGs的形成,这表明HPIV3包涵体抑制其病毒感染诱导SGs的形成与其结合病毒RNA的能力有关。本研究阐明了 HPIV3诱导细胞形成抗病毒SGs的分子机制,并首次发现了病毒包涵体参与调控SGs形成的新功能。
【图文】：

种认为翻译起始被抑制的ＲＮＰｓ复合物先寡聚成核，随着ＲＮＰｓ复合物的增多逡逑逐渐变大形成ＳＧｓ的内核，多个内核相互融合并招募外壳形成成熟的ＳＧｓ。另逡逑一种则认为翻译起始被抑制的ＲＮＰｓ复合物先寡聚化形成分离相的液滴，然后逡逑随着ＲＮＰｓ复合物的增多而变大，最后由于液滴中蛋白浓度的升高而逐渐形成逡逑ＳＧｓ的内核。ＴＩＡ１／ＴＩＡＲ和Ｇ３ＢＰ在ＳＧｓ的组装过程中起着重要作用，过表达逡逑这些蛋白可以促进３0３自发组装（１＇0１１１＾％１＾１３１．，２００３）。过表达！＇１八－１的？１１０逡逑结构域可以抑制ＳＧＳ的组装（Ｇｉｌｋｓ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００４）。敲除ＭＥＦ细胞中的ＴＩＡ－１或逡逑者ＴＩＡＲ蛋白极大地削弱了该细胞形成ＳＧｓ的能力（Ｇｉｌｋｓ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００４）。沉默逡逑Ｇ３ＢＰ的表达或者过表达Ｇ３ＢＰ中富含ＰｘｘＰ的结构域也可以抑制ＳＧｓ的组装过逡逑程（Ｔｏｕｒｒｉｅｒｅ，Ｈ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００３）。Ｇ３ＢＰ的磷酸化也参与调控ＳＧｓ的组装，当过表逡逑达一种模拟Ｇ３ＢＰ磷酸化的突变体Ｇ３ＢＰＳ１４９Ｅ也会抑制ＳＧｓ的组装（Ｔｏｕｒｒｉｅｒｅ，，逡逑Ｈ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００３邋）。逡逑（Ａ）逦Ｃｏｒｅｓ邋ｆｉｒｓｔ邋■邋＿邋Ｓｈｅｌｌ逡逑

图１．５邋■一些病毒抑制ＳＧｓ形成的模式图逡逑４．３邋—些病毒整个感染过程中都不抑制ＳＧｓ的形成逡逑随着长时间地进化，有些病毒可以诱导ＳＧｓ的生成，并且在其整个感染过逡逑程中都不抑制ＳＧｓ的形成，其中一些病毒反而可以利用ＳＧｓ或者ＳＧｓ中的一些逡逑组分帮助病毒完成复制转录。逡逑有研究表明ＲＳＶ可能利用ＳＧｓ抑制宿主细胞的蛋白翻译，从而能获得更多逡逑的资源帮助病毒自身完成复制。用ＲＳＶ感染Ｈｅｐ－２细胞，２４邋ｈ后收样，大约有逡逑３０％的细胞中形成ＳＧｓ，通过免疫荧光实验观察发现，在形成有ＳＧｓ的细胞中，逡逑ＲＳＶ的包涵体比没有ＳＧｓ的细胞中的更大，而包涵体结构又被认为是ＲＳＶ病逡逑毒复制转录的中心，所以这可能表明ＳＧｓ有利于病毒的复制转录。并且，当沉逡逑默Ｇ３ＢＰ的表达时，细胞形成ＳＧｓ的能力大大降低，此时再用ＲＳＶ感染细胞发逡逑
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R373.13

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本文编号：2616426