生物3D打印的微环境诱导乳腺祖细胞向汗腺细胞分化的研究

发布时间：2020-04-06 03:00

【摘要】：目的(1)探究小鼠汗腺细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白在二维(two-dimensional,2D)培养环境下对小鼠乳腺祖细胞(Mammary Progenitor Cells,MPCs)体外分化过程中的作用。(2)探究生物三维(three-dimensional,3D)打印的汗腺微环境对MPCs在体外分化过程中的作用,为应用组织工程技术构建体外适宜的细胞生长微环境提供可靠的理论基础。(3)探究MPCs在体外构建的汗腺微环境中的分化方向,为体外构建能定向诱导细胞分化的理想微环境提供新的研究思路。(4)探究生物3D打印的汗腺微环境诱导MPCs分化的可能机制,为生物3D打印汗腺微环境在临床中的应用提供理论基础。方法(1)取新生小鼠足部匀浆作为汗腺细胞外基质蛋白的来源。分别提取新生小鼠的MPCs和成年小鼠的汗腺细胞,通过查阅大量文献并利用免疫荧光染色技术筛选出MPCs与汗腺细胞中所表达的差异蛋白即汗腺发育过程中的钠/钾通道蛋白(Adenosine Triphosphate 1a1,ATP1a1)。MPCs在2D环境条件下培养时向培养基中加入汗腺细胞外基质蛋白,收集细胞后采用免疫荧光和反转录定量聚合酶链反应(Real-time Quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)技术检测其差异蛋白的表达情况从而探究汗腺细胞外基质蛋白在2D培养环境下对MPCs分化的作用。(2)明胶和海藻酸钠经磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)充分溶解后按比例配制成可打印的生物墨水并加入汗腺细胞外基质蛋白,包裹MPCs后利用生物3D打印技术将其打印成多层网格状从而构建体外汗腺微环境模型。对照组设置为与实验组相比无汗腺细胞外基质蛋白组和未打印组。光镜下观察各组细胞在微环境中的增殖发育情况。通过免疫荧光分析和RT-qPCR技术检测MPCs中差异蛋白的表达情况并探究生物3D打印的汗腺微环境对MPCs分化的影响。(3)分离提取在生物3D打印的汗腺微环境中培养7和14天的MPCs,应用免疫荧光染色和RT-qPCR技术分别在蛋白和分子水平上检测经诱导后的细胞中汗腺腔上皮和肌上皮细胞特异蛋白CK8和CK14的表达情况,并进一步通过免疫荧光双染的方法观察诱导细胞中两种特异蛋白与差异蛋白ATP1a1共定位的结果,从而进一步探究MPCs在生物3D打印的汗腺微环境中的分化方向。(4)前期实验成果及查阅文献证明小鼠汗腺发育过程中涉及的信号转导通路包括EDA、NF-κb、Shh信号通路等。收集在汗腺微环境中诱导7和14天的细胞,应用RT-qPCR技术分析以上通路在诱导后细胞中的表达情况。筛选出表达明显上调的信号通路并在诱导过程中加入该信号通路的抑制剂,应用RT-qPCR技术来进一步检验此信号通路在诱导后细胞中的表达情况,从而探究生物3D打印的汗腺微环境诱导MPCs向汗腺分化的相关机制。根据文献报道,测定微环境的硬度,推测微环境硬度对MPCs分化方向的影响。结果(1)2D培养环境条件下,无论培养环境中是否添加汗腺细胞外基质蛋白,MPCs中汗腺细胞特异蛋白ATP1a1的表达均为阴性。结果表明汗腺细胞外基质蛋白在2D培养环境下不能特异性诱导MPCs向汗腺细胞分化。(2)对照组中培养的细胞其免疫荧光和RT-qPCR结果均显示其无明显的特异蛋白ATP1a1表达。而培养在生物3D打印后的汗腺微环境中的MPCs表达差异蛋白ATP1a1,并在诱导第14天时表达有明显的上调。免疫荧光染色结果显示乳腺细胞特异表达的蛋白雌激素受体α(Estrogen Receptor-α,ER-α)在ATP1a1表达上调的细胞中其表达水平较未诱导时有明显的降低。分光光度计分析结果显示使用的汗腺细胞外基质蛋白中无残留的细胞成分,因此排除了汗腺相关细胞对这一诱导过程的干扰作用。这一结果证明了生物3D打印的汗腺微环境可以诱导MPCs向汗腺细胞特异分化,使生物3D打印在汗腺再生中具有重要意义。(3)免疫荧光和RT-qPCR结果进一步显示,MPCs经生物3D打印的汗腺微环境诱导14天后,细胞中CK8的表达特异性上调。免疫荧光共定位结果示诱导后的细胞中ATP1a1与CK8共表达而与CK14无共表达现象。综上可知,本实验构建的生物3D打印的汗腺微环境诱导MPCs向汗腺腔上皮细胞方向特异性分化,为构建理想的体外细胞和组织发育的微环境提供了新的思路。(4)RT-qPCR结果证明Shh信号转导通路在生物3D打印的汗腺微环境诱导MPCs向汗腺细胞分化的过程中的表达量明显上调。微环境经Shh信号通路的抑制剂处理后,RT-qPCR结果显示,在培养第14天时细胞中ATP1a1与CK8的表达量明显低于未经抑制剂处理的细胞。此结果证明了Shh信号通路在生物3D打印的汗腺微环境诱导MPCs向汗腺细胞分化过程中具有重要作用,为进一步研究体外汗腺再生奠定了坚实的基础。而微环境硬度的检测结果显示对照组硬度约是实验组的2倍,根据相关文献推测硬度较小的实验组微环境更有利于诱导MPCs向汗腺腔上皮细胞方向分化。结论本实验对生物3D打印的汗腺微环境诱导MPCs向汗腺细胞分化的过程进行了研究并对其相关机制进行了初步探索。发现汗腺细胞外基质蛋白结合生物3D打印所构建的汗腺发育特异的体外微环境与2D环境和未经打印的三维环境相比可以有效诱导MPCs向汗腺腔上皮细胞分化并且有功能性蛋白的表达。其中Shh信号通路在这一诱导过程中发挥了重要作用。微环境的硬度也可能影响了MPCs的分化方向。本实验为今后利用生物3D打印技术构建理想的微环境和体外汗腺的再生提供了良好的理论基础和新的思路。
【图文】：

汗腺细胞,小鼠,细胞形态,祖细胞

天津医科大学硕士学位论文一、小鼠乳腺祖细胞与汗腺细胞的比较及其在 2D 诱导环境下的分化情况学意义。1.2 结果1.2.1 小鼠乳腺祖细胞与汗腺细胞在形态功能上的异同以及差异蛋白的筛选小鼠汗腺细胞和小鼠 MPCs 经分离提取，条件培养基培养后，通过显微镜观察到两种细胞的形态相似，均成团增殖，如鹅卵石样排列（见图 1.1）。

小鼠,汗腺细胞,细胞形态

观察到两种细胞的形态相似，均成团增殖，如鹅卵石样排列（见图 1.1）。图 1.1 显微镜下观察提取的小鼠汗腺细胞与 MPCs 的细胞形态。A：小鼠汗腺细胞形态；B：小鼠 MPCs 细胞形态。（标尺：200μm）在对小鼠 MPCs 进行 CK14 和 CK19 的免疫荧光共定位时，，我们发现在本实验采用的细胞提取方法提取的小鼠 MPCs 中两种蛋白的表达均为阳性（见图 1.2），从而可以初步鉴定此细胞为小鼠 MPCs。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R329.2;TP391.73

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