维生素D与非洲疟疾DALY关系及其预防脑疟免疫机制的研究

发布时间：2020-04-07 20:37

【摘要】：目的:疟疾是一种经按蚊叮咬而感染疟原虫所引起的全球性虫媒传染病,约34亿人存在着感染的风险,目前仍有九十多个国家存在着疟疾,脑疟是疟疾最严重的并发症。在撒哈拉以南非洲地区儿童发病率及病死率高,营养不良被公认是其重要的影响因素之一。近来的研究表明,维生素D(Vitamin D,VD)不足在非洲地区是一个常见的营养不良问题,公众会误认为VD的缺乏应该只发生在赤道南北纬35度以上的区域范围,而在非洲地区生活的人群多靠近赤道,由于得到充足的光照,不会存在VD不足的情况。但现实的研究表明,即使在日照充足的地区,也存在着VD缺乏的问题。除了光源性维生素D来源外,食源性维生素D的缺乏可能是另一个重要的因素。患有重症疟疾儿童的血清VD水平显著低于健康人群的儿童。目前越来越多的科研工作者开始关注维生素D的基础研究,认为其可以通过调节免疫系统发挥其抗感染作用。人类脑型疟疾的分子及细胞机制主要包括促炎细胞因子表达水平的上升、NF-κB通路引起内皮激活导致细胞粘附因子的上调,神经胶质细胞活化及感染红细胞、单核细胞、血小板在脑毛细血管的隔离。近来有研究发现钙三醇在体外具有抗疟疾能力。有研究报告称,在感染伯氏疟原虫的小鼠中,感染后治疗性使用维生素D可使小鼠感染脑型疟疾的感染率和死亡率降低。为此,我们根据联合国粮食及农业组织(Food and agriculture organization of the united natio,FAO)数据库、美国农业部数据库(United States Department of Agriculture,USDA)、全球疾病负担网站(Global Burden of Disease,GBD),系统地进行了非洲38个国家主要的7种食物消费维生素D水平与非洲疟疾病死率(Death)、伤残调整生命年(Disability Adjusted of Life,DALY)、死亡损失寿命年(Years of Life Lost,YLL)、伤残损失寿命年(years lived with disability,YLD)关系的研究;预防性补充VD对实验脑疟模型(Experimental cerebral malaria,ECM)的免疫调节效应及其相关机制和VD对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节效应及其相关机制研究,旨在为疟疾的有效防治提供新的理论依据,从而制定更为有效的抗疟策略。研究方法:1.非洲撒哈拉以南38个国家食物消费维生素D水平计算非洲38个国家7种食物成分中VD含量,得出各国食物消费量日人均维生素D量。以此与各国疟疾DALY进行相关分析,并分为高低剂量组进行比较分析。2.小鼠感染及原虫血症观察通过腹腔注射1×10~6P.b ANKA寄生的红细胞(pRBC)感染小鼠,感染后每日取尾静脉血涂片,Giemsa染液染色,镜检计数红细胞感染率。每日观察小鼠的生存情况和状态,以及是否患有脑疟。3.小鼠VD处理C57BL/6小鼠随机分为4组,分别为正常小鼠未感染组(uninfected),PbA感染组(PbA),PbA感染对照组(油+PbA),Pb感染前预防性补充VD组(VD+PbA)。Pb感染前预防性补充VD组(VD+PbA)在小鼠感染PbA前五天起每日灌胃给予VD(50μg/kg),同时,PbA感染对照组(油+PbA)在VD给药相同时间点给予相同体积的大豆油。4.小鼠血脑屏障通透性检测小鼠感染第五天后各组取小鼠尾静脉注射200μl2%伊文思蓝染料。一小时后,心脏灌注生理盐水,处死小鼠后立即取脑并拍照。将小鼠的脑放入离心管中,每管加入2ml甲酰胺,孵育后离心,取上清液200μl,置于96孔板中,检测波长为630nm的吸光度并计算EB含量。5.巨噬细胞RAW264.7体外培养实验分为四组,分别为只加入培养基的Normol组;只加入有效浓度VD的VD组(浓度为10nM);只加入LPS(1μg/ml)的LPS组为对照组;实验组VD+LPS组中每孔分别加入10nM的VD,再加入1μg/ml的LPS。每组设置2个复孔,培养48小时后分别收上清及细胞。6.RNA提取及Real-time RT-PCR取脑、脾及巨噬细胞RAW264.7提取RNA,用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒去除残存的基因组DNA后,将RNA反转录合成cDNA。用得到的cDNA产物作为模板,进行RT-qPCR反应。采用2~(-ΔΔCT)法量化各个分组的相对基因表达情况。7.ELISA检测取小鼠血清、脾培养上清、脑、巨噬细胞RAW264.7培养上清用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(RD Systems,Minneapolis,MN,USA)进行检测。按照试剂盒说明书进行操作。8.流式细胞术制备小鼠脾细胞、脑细胞、巨噬细胞单细胞悬液,染色后用流式细胞仪进行检测,Flowjo软件分析。9.统计学分析所有数据均以均数±标准差(x±s)表示,多组间数据用Prism7统计软件进行多组均数的单因素方差分析(ANOVA),组间比较用q检验,标本采用独立样本t检验比较分析组内和组间均值差异,采用Kaplan Meyer方法进行生存期分析。P0.05为显著差异。结果:1.非洲儿童处于维生素D严重不足的状态非洲38个国家平均食物消费维生素D水平很低。各国平均食物消费维生素D与DALY、Death、YLL具有显著负相关。30国家维生素D平均值低于2μg(80IU)/day以下,远低于WHO推荐水平。只有8国高于5μg/day。以此将各国维生素D划分两组进行比较分析,DALY、YLL和YLD均具有显著性差别。2.预防性补充显著升高P.bANKA感染C57BL/6小鼠血清中25(OH)D_3水平感染后第5天,处死小鼠取血清检测小鼠血清中VD含量。结果显示,PbA感染组(PbA)及预防性使用VD组(VD+PbA)的小鼠VD水平可见显著差异,且个体之间差异较大。3.预防性补充VD显著防止P.b ANKA感染的C57BL/6小鼠CM的发生PbA感染组与PbA感染对照组(油+PbA)在小鼠症状、生存期、脑疟发生率、原虫血症等方面并无差异,但与预防性补充VD组(VD+PbA)相比,在各方面均可见显著差异。4.预防性补充VD显著改善实验性脑疟的病理改变PbA感染组(PbA)血脑屏障完整性明显破坏,有很明显的EB外渗,预防性补充VD组(VD+PbA)只可见少量EB外渗。5.预防性补充VD可显著减少T细胞向脑组织迁移感染第5天,两组小鼠脑组织的CXCR3、CXCL9和CXCL10均可见明显升高。预防性补充VD组(VD+PbA)显著降低了脑组织中趋化因子CXCR3、CXCL9及CXCL10的表达。6.预防性补充VD抑制Th1细胞免疫应答,降低IFN-γ、TNF-α水平预防性补充VD组(VD+PbA)小鼠脾细胞中Th1型细胞所占比例明显降低。在血清及脾培养上清中,感染后第5天,预防性补充VD组(VD+PbA)的IFN-γ和TNF-α表达量与PbA感染组(PbA)相比显著降低。与PbA感染组(PbA)相比,预防性补充VD组(VD+PbA)小鼠脾细胞中IFN-γ和TNF-α的mRNA表达水平及小鼠脑细胞IFN-γ和TNF-α的mRNA表达水平亦可见明显的降低。7.预防性使用VD提高Tregs数量并增加IL-10、TGF-β分泌感染第3天,预防性补充VD组(VD+PbA)脾细胞中Tregs的数目明显低于PbA感染组(PbA)脾细胞中Tregs的数目。与PbA感染组(PbA)相比,预防性补充VD组(VD+PbA)小鼠血清TGF-β及脾培养上清IL-10及TGF-β的水平在感染后第5天显著高于PbA感染组(PbA)。8.预防性使用VD抑制DC的分化、成熟及活化在小鼠感染后第5天,PbA感染组(PbA)髓样DCs(mDCs)和浆样DCs(pDC)数量及比例略高于预防性补充VD组(VD+PbA),与PbA感染组(PbA)相比,预防性补充VD组(VD+PbA)DCs共刺激分子MHC-II的比例表达略有降低。9.预防性使用VD抑制分泌IL-1、IL-6、IL-12数据显示,在感染PbA第3、5天,与PbA感染组(PbA)相比,预防性补充VD组(VD+PbA)血清、脾上清的IL-1、IL-6、IL-12水平及脾IL-1、IL-6、IL-12的mRNA表达水平均有明显的减少。对体外巨噬细胞RAW264.7的刺激也显示出相似的结果。10.预防性使用VD抑制NF-κB表达预防性补充VD组(VD+PbA)脾细胞NF-κB的mRNA表达水平显著减少。11.VD可抑制巨噬细胞RAW264.7 TLR4、TLR9及CD40的表达与LPS组相比,VD+LPS组CD40、TLR4、TLR9表达水平明显下降,预防性补充VD组(VD+PbA)TLR4及TLR9的mRNA表达水平与LPS组相比显著下降。12.VD可抑制巨噬细胞RAW264.7 Th1型炎症因子的释放VD+LPS组TNF-α的表达水平与LPS组相比明显降低。除此之外,VD+LPS组的TNF-α的mRNA表达水平显著降低。13.VD可抑制巨噬细胞RAW264.7对淋巴细胞的刺激作用流式细胞术结果表明,LPS刺激可使巨噬细胞RAW264.7 CD80、CD86、MHC-II分子表达水平显著上升,发现CD80、CD86的表达水平VD+LPS组与LPS组相比明显降低,预防性补充VD组(VD+PbA)MHC-II的mRNA表达水平与LPS组有显著下降。结论:非洲38个国家来自食物消费的人均维生素D水平很低,平均值也仅仅是可达4μg/日人均消费维生素D。而30个国家的日人均消费维生素D不足2μg(80IU)以下。远低于WHO推荐的5μg(200IU)和美国医学研究院推荐1-70岁人群的维生素D每日摄入量为15μg(600 IU),70岁及以上为20μg(800IU)。这足以证明,在非洲儿童处于维生素D严重不足的状态。我们对维生素D与DALY的研究结果表明,维生素D是疟疾的保护因素。预防性补充VD可显著防止P.b ANKA感染的C57BL/6小鼠CM的发生,降低小鼠的死亡率,改善实验性脑疟的病理改变。VD可抑制DC的分化、成熟及活化,影响脾脏DCs数量,减少巨噬细胞RAW264.7 CD80、CD86、MHC-II分子表达,进而抑制巨噬细胞RAW264.7的抗原提呈功能。VD还可抑制巨噬细胞RAW264.7TLR4、TLR9及CD40的表达,减少NF-κB通路的作用,并抑制巨噬细胞分泌IL-1、IL-6、IL-12及Th1型炎症因子TNF-α,进一步减少抗原提呈细胞对淋巴细胞的刺激作用。预防性补充VD可抑制Th1细胞免疫应答,提高Tregs数量并增加IL-10、TGF-β分泌,抑制炎症反应的发生。除此之外,预防性使用VD抑制NF-κB表达,也可进一步抑制炎症反应。从而减少脑中趋化因子CXCL9、CXCL10和粘附分子ICAM-1、VCAM-1,的表达,进而降低CD8~+T细胞在脑中的积聚,改善血脑屏障的完整性,最终防止脑疟的发生。
【图文】：

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图 1 非洲 38 个国家 7 种食物累加日人均维生素 D 经年变化示 Congo 等 8 个国家的日人均 VD 量较高，均在 4μg 以上，其中 Gabon 最高，其高达 10μg；Namibia 等 30 个国家的日人均 VD 量偏低，均在 4μg 以下，其中 Sier3 年开始呈上升趋势。为了清晰地描述非洲 38 个国家食物消费维生素 D 集中水平国食物消费维生素 D 水平所在年份升序排列（不扩展），再将 38 个国家按 8 和求各组均值，，产生图 2。

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图2两组不同食物消费维生素D水平经年Y 化
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

【参考文献】