PHD2-shRNA增强大鼠BMSC抗氧化应激损伤能力的实验研究

发布时间：2020-04-07 17:58

【摘要】：【背景】骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)移植疗法因有望修复心肌梗死导致的受损心肌组织而成为研究热点。梗死区域的组织微环境因缺血缺氧诱发氧化应激反应不利于移植BMSCs存活,从而限制了BMSCs的疗效。研究发现,脯氨酸羟化酶2(Prolyl hydroxylase 2,PHD2)和缺氧诱导因子1α(Hypoxia-inducible factor-1alpha,HIF-1α)是调控细胞在缺氧环境中存活的重要物质。PHD2是HIF-1α的负性调节因子。在常氧状态下,PHD2通过羟化作用降解HIF-1α;在缺氧状态下,PHD2失活,HIF-1α丰度增高。HIF-1α可作为转录因子被转运至细胞核中参与调节细胞在缺氧状态下的代谢增殖等细胞活动,提示沉默PHD2可能对氧化应激环境中的MSC具有保护作用。【目的】本研究旨在通过shRNA-PHD2修饰BMSCs,探究沉默PHD2表达对BMSCs耐受氧化应激损伤的作用。【方法】全骨髓贴壁法提取SD大鼠BMSC;构建带有目的基因PHD2-shRNA的慢病毒载体系统并转染BMSCs,筛选出稳定表达PHD2-shRNA的BMSCs群(shPHD2-MSC);构建体外氧化应激损伤模型,将实验细胞分为MSC组,MSC+H2O2组,shPHD2-MSC+H2O2组,为模拟HIF-1α作用失活,再添加shPHD2-MSC+H2O2+YC-1实验组。光镜观察MSC形态及分布。流式细胞术检测MSC表面特异性CD分子。油红染色分析BMSC定向成脂分化,茜素红染色分析成骨分化。RT-PCR检测细胞中PHD2和HIF-1α的mRNA表达,Western blotting检查技术检测细胞中PHD2和HIF-1α的蛋白表达。TUNEL染色和Annexin VAPC/7-AAD双染色法流式检测细胞凋亡。【结果】1.光镜下观察MSC呈长梭形,以旋涡或者平行状排列生长。2.流式细胞学分析结果显示MSC表面CD分子表达情况分别为:CD29(91.27%),CD90(92.04%),CD45(0.45%),CD34(0.04%)。3.油红染色BMSC定向成脂分化结果显示,BMSCs分化成的脂肪细胞中脂滴饱满且可被油红染色为红色。茜素红染色BMSC定向成骨分化结果显示,BMSCs分化成的骨细胞中的钙化结节和细胞间的钙盐沉积可被茜素红染成红色。4.RT-PCR检测结果显示,与MSC组比较,shRNA-MSC组中,PHD2的m RNA表达降低,而HIF-1α的mRNA表达升高,差异均具有统计学意义(p0.05)。Western blotting检测蛋白表达结果趋势与RT-PCR结果趋势一致,与MSC组比较,shRNA-MSC组中,PHD2的蛋白表达降低,而HIF-1α的蛋白表达升高,数值差异具有统计学意义(p0.05)。5.TUNEL染色检测结果显示,与MSC+H2O2组比较,shPHD2-MSC+H2O2组细胞凋亡数量明显减少,数值差异具有统计学意义(p0.05)。6.Annexin V-APC/7-AAD双染色法流式结果与TUNEL染色结果一致,与MSC+H2O2组比较,shPHD2-MSC+H2O2组细胞凋亡数量明显减少,两组凋亡率的差异具有统计学意义(p0.05);而shPHD2-MSC+H2O2+YC-1组细胞凋亡数量明显多于shPHD2-MSC+H2O2组,两组数值差异具有统计学意义(p0.05)。【结论】沉默PHD2的表达能明显减少氧化应激环境中MSC的凋亡率,并且主要依赖受PHD2调节的HIF-1α作用,该研究为解决干细胞治疗心梗面临的细胞定植率等问题提供了体外研究的基础。
【图文】：

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文结 果1 骨髓间充质干细胞的形态、表型和功能鉴定1.1 光镜下观察 BMSC 形态收集骨髓腔冲洗液中的细胞种在 25cm2，，24h 后半定量换液，约两至三天可见长梭形细胞贴壁生长，培养七天左右与可见长梭形细胞呈旋涡状或放射状成片生长，形成明显的细胞集落（见图 1A）。第一代和第二代细胞生长状态最佳，增殖速度快，细胞形态多呈纺锤形（见图 1B 和图 1C），传代至第三代的细胞形态无明显改变，贴壁细胞融合度达 80%左右时，可见细胞分布规则，多为平行或旋涡状走形（见图 1D）。

流式细胞技术检测MSC胞膜表面特异性CD分子
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R542.22;R-332

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