甲基苯丙胺疫苗效力评价方法初步建立及其佐剂研究

发布时间：2020-04-07 17:28

【摘要】：甲基苯丙胺((+)-methamphetamine,METH)滥用已成为一个全球公共卫生问题,造成重大的疾病及经济负担。目前没有批准可用于治疗METH滥用的药物,疫苗为治疗METH提供了一个新的策略。首先,为了建立一种合适的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测抗METH抗体,本研究第一部分先合成METH半抗原,再将METH半抗原分别与破伤风类毒素(TT)和牛血清白蛋白(BSA)偶联,成功制备METH免疫抗原TT-METH与包被抗原BSA-METH,偶联率分别为73:1及20:1。然后将TT-METH偶联疫苗免疫小鼠,制备抗血清。利用BSA-METH包被酶标板检测抗METH抗体,进行ELISA条件的摸索优化,最佳包被缓冲液为PBS,包被蛋白浓度为2 μg/ml,包被条件为37℃2h后4℃过夜;最佳封闭液为5%脱脂奶粉,封闭条件为37℃2h;最适的酶标抗体浓度为1:3000(1.33μg/ml),37℃孵育1h;底物最佳显色时间为15min。实验批内变异系数及批间变异系数均在5%以内,重复性较好。包被抗原不与TT免疫小鼠后的血清发生反应且抗TT-METH的血清不与BSA发生反应,特异性较好。其次,为了建立简便的体内生物材料中METH的液相色谱质谱联用(LC/MS)检测分析方法以研究疫苗对METH体内分布的改变,本研究第二部分首先进行了生物材料中METH不同提取方法的比较,提取率较高的为甲醇结合超声提取。然后对所建立的方法进行评价,所建立的方法专属性好,在10-2000ng/ml的范围内的线性良好,相关系数(r2)在0.9995-0.9999之间,回收率在96%-102.12%之间,精密度良好,变异系数(CV)5.72%,处理后的样品稳定性较好。最后利用建立的LC/MS分析方法研究了不同剂量的METH在小鼠体内的血脑分布。研究显示0.5-4 mg/kg剂量下血液及脑组织中METH的浓度均在15 min时最高,随后逐渐递减。不同时间点血液及脑组织中的浓度均具有剂量依赖关系,血液中的METH含量与脑组织中的METH含量在剂量为0.5-4 mg/kg范围内呈线性依赖关系。最后,我们开发了一种新型的油包水型纳米乳佐剂(命名为NES01)用于TT-METH疫苗中。NES01平均粒径为62.9 nm,多分散系数为0.146,颗粒分布均匀。NES01稳定性较好。将NES01佐剂联合TT-METH免疫小鼠具有良好的安全性,能够有效增强TT-METH疫苗的抗体水平,显示出较好的佐剂效果。综上所述,本研究成功合成METH抗原TT-METH及BSA-METH,并建立了抗METH抗体的ELISA检测方法;建立了小鼠体内METH的LC/MS检测方法。开发一种新型纳米乳佐剂NES01,具有较好的佐剂效果,可作为METH疫苗的一种候选佐剂。
【图文】：

对药物结构进行修饰，给药物加上一段连接臂，得到半抗原；半抗原的连接臂可与逡逑大分子载体蛋白进行生物结合形成免疫偶联化合物，将其与佐剂配伍注入机体后，逡逑免疫系统能够识别并诱发抗ＭＥＴＨ半抗原的特异性抗体（见下一页图１，ＢｒｅｍｅｒＰＴ逡逑和邋Ｊａｎｄａ邋ＫＤ邋２０１７邋年在邋Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ邋Ｖａｃｃｉｎｅ邋Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ邋ｆｏｒ邋Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ邋Ｕｓｅ邋Ｄｉｓｏｒｄｅｒ逡逑一文中所作）［５８］。逡逑当ＭＥＴＨ进入机体，抗体可与ＭＥＴＨ结合，在循环系统内形成抗体－ＭＥＴＨ复逡逑合物，形成的复合物分子量大以至于无法穿过血脑屏障，因此，会降低ＭＥＴＨ进入逡逑大脑的速率和数量，，从而阻止或减少目标药物作用于大脑中的受体［５８］；然后抗体结逡逑合的药物再在平衡状态下从与抗体结合缓慢释放作为残留的游离药物被代谢和消逡逑除。降低ＭＥＴＨ进入大脑的速率和数量应该减弱其引起的行为效应，包括奖赏效逡逑应。研究显示血液中的抗ＭＥＴＨ抗体通过减少和减慢ＭＥＴＨ进入血脑屏障［５１，５２］，逡逑阻断由ＭＥＴＨ诱导的自发活动、体温调节和精神运动ｆ％，并抑制其自我给药［５４］。逡逑７逡逑

以二氯甲烷：丙酮：乙酸＝３０：邋１０：邋１的比例作为展开剂对ＭＥＴＨ及合成的逡逑ＭＥＴＨ进行ＴＣＬ检测，样品不同组分由于移动速度不同而彼此分离。展开后的薄逡逑层板经过干燥后，用紫外灯照射检出斑点，结果如图１．１。展开分离后，化合物在薄逡逑层板上的位置用比移值（７？／值）来表示：ＭＥＴＨ的比移值b6原点至斑点中心距离逡逑／原点至展开剂前沿距离：／？／＝７．７／９．０＝０．８６；邋ＭＥＴＨ半抗原的比移值b6原点至斑点逡逑中心距离／原点至展开剂前沿距离：５／９．０＝０．５６。由展开ＴＣＬ图及及／值可知，合逡逑成的产物中无起始原料ＭＥＴＨ，即ＭＥＴＨ全部参与了反应。逡逑ＭＥＴＨ逦逡逑ＭＥＴＨ邋半抗原逦逡逑１邋２逡逑图１．１邋ＭＥＴＨ半抗原ＴＣＬ检测１－ＭＥＴＨ，２－ＭＥＴＨ半抗原逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋ＴＬＣ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＭＥＴＨ邋ｈａｐｔｅｎ邋１邋－ＭＥＴＨ，邋２－ＭＥＴＨ邋ｈａｐｔｅｎ逡逑３．１．２逦ＭＥＴＨ的核磁表征逡逑以ＴＭＳ作为内标对于合成的ＭＥＴＨ进行１Ｈ核磁谱图表征，结果见下一页图逡逑１．２，从核磁谱图中，化合物ＭＥＴＨ的苯环的化学位移７－７．５ｐｐｍ处找到
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392-33

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本文编号：2618180