DENV-2感染的HUVECs与巨噬细胞相互作用对主要炎性细胞因子产生的影响

发布时间：2020-04-11 14:13

【摘要】：目的:研究人原代脐静脉内皮细胞(primary human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)被登革热2型病毒(Dengue virus 2,DENV-2)感染后,与单核细胞诱导培养的人巨噬细胞(Macrophages,M?)共培养,观察对两种细胞分别产生主要炎性因子的影响。方法:密度梯度离心法从人体外周血浓缩白细胞中分离单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),贴壁得到单核细胞,通过巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)刺激,流式细胞术检测CD14~+CD11b~+细胞纯度,得到M?。DENV-2感染HUVECs,Real-time PCR检测HUVECs细胞内病毒NS1 mRNA表达量变化。HUVECs被DENV-2感染后,通过Transwell法与M?共培养,对照组用磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate S1P)1型特异性受体激动剂CYM-5442预处理24h去除药物后感染病毒。Real-time PCR分别检测HUVECs产生的IL-6、IL-8 mRNA和M?产生的IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1βmRNA的逆转录水平;ELISA双抗体夹心法检测培养上清中上述细胞因子的表达。结果:HUVECs被感染DENV-2后,细胞内NS1基因转录水平逐渐上升,24h时达峰值(2.66±0.53,P0.05)后下降。流式细胞术检测M?纯度为89.16±2.07%。HUVECs被DENV-2感染后IL-6、IL-8 mRNA转录水平均上调,24h mRNA转录量达到峰值;IL-6为16.1±0.17,IL-8为29.76±0.58。未感染组转录水平IL-6为1.46±0.67,IL-8为1.6±0.54。M?被感染后IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1βmRNA表达量均有明显上升,在24h mRNA IL-6表达量为45.82±3.72,IL-8为52.34±1.69(12h),TNF-α为28.94±1.75,IL-1β为30.96±1.44;未感染组转录水平IL-6为1.16±0.22,IL-8为1.15±0.21,TNF-α为1.11±0.09,IL-1β为1.47±0.31。HUVEC与M?共培养后上述细胞因子在各时间点的转录水平有所下降,依然明显高于未感染对照组。CYM-5442预处理后,共培养组感染的HUVEC IL-6、IL-8的mRNA转录水平明显下降(P0.01),M?中IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1βmRNA转录水平也有下调(P0.01)。DENV-2感染的HUVEC与巨噬细胞共培养与未感染对照组相比,培养上清中IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-α、IL-1β分泌量明显上升。结论:DENV-2能够感染原代HUVECs,且被DENV-2感染的HUVEC能够活化M?并促使其分泌大量的IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β,同时CYM-5442预处理HUVECs后,能够减少病毒感染HUVECs引起的主要细胞因子分泌量,一定程度减轻内皮细胞的损伤。
【图文】：

注：1. Marker 2. NS1 序列扩增图 2-2 DENV-2 NS1 部分序列扩增on of NS1 gene in C6/36 cells infectedV-2 毒力V-2 感染后，每天观察细胞病变合等典型的病毒感染细胞病变（计算病毒 TCID50值为 10-5.8/0.1表 2-1 DENV-2 毒力测定（TCID5Tab. 2-1 DENV-2 Toxicity Test（TC无病变孔数累 计病变孔数无病变孔数0 42 0

苏培养传代后 2 天即可长满 95%左右，细胞贴壁呈梭型(图 2-图 2-3 HUVECs（×200）Fig.2-3 HUVECs（×200）细胞的鉴定PBMC，，贴壁后得到单核细胞，加入 M-CSF 刺激得到巨噬细胞（检测巨噬细胞（M ）纯度为 89.16±2.07%（图 2-4）。
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392

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本文编号：2623682