SPATA1与纤毛内转运蛋白IFT20的相互作用及其在精子发生中的表达和定位

发布时间：2020-04-12 07:27

【摘要】：目的:进一步验证精子发生相关蛋白SPATA1与鞭毛内转运蛋白IFT20之间的相互作用,探索SPATA1在精子发生中的表达、定位及作用。方法:IFT20和SPATA1蛋白表达质粒转染CHO细胞,免疫荧光检测其共定位;同时,IFT20/Flag和SPATA1/GFP共转染COS-1细胞,细胞裂解物进行免疫共沉淀,进一步验证两者之间的相互作用。构建SPATA1/pEGFP-N2质粒,将其和对照质粒pEGFP-N2转染到COS-1细胞中,细胞裂解物进行Western blotting,检测SPATA1多克隆抗体的特异性。以SPATA1和IFT20为一抗,免疫荧光染色观察两者在睾丸生精细胞的表达与定位。收集野生型小鼠附睾精子,Western blotting和免疫荧光检测SPATA1在成熟精子中的表达。提取Ift20基因敲除小鼠和对照小鼠睾丸的总蛋白以及制备睾丸组织切片,Western blotting和免疫荧光检测IFT20缺失对SPATA1在睾丸组织中的表达与定位的影响。结果:细胞内蛋白定位实验结果显示IFT20和SPATA1在CHO细胞中部分共定位,形成簇团;COS-1细胞共转染IFT20/Flag和SPATA1/GPF表达质粒时,Flag抗体将IFT20和SPATA1同时沉淀下来。Western blotting实验显示制备的SPATA1抗体能有效识别该蛋白。小鼠睾丸组织和附睾成熟精子的免疫荧光染色显示,在圆形精子细胞的顶体检测到SPATA1蛋白信号,但在成熟精子未发现该蛋白的表达。IFT20也定位于圆形精子细胞的顶体。与对照组小鼠(Ift20~(flox/+);Stra8-Cre)相比,IFT20缺失对睾丸组织中SPATA1蛋白表达水平没有显著影响。免疫荧光结果显示,精子发生的IV-XII期间,Ift20基因敲除小鼠和对照小鼠中SPATA1表达与定位相似;在精子发生第12阶段(step12),Ift20基因敲除小鼠的精子细胞核未正常伸长,SPATA1未沿着顶体分布。结论:SPATA1与IFT20形成蛋白复合体,并可能通过调控IFT20介导的蛋白运输参与精子顶体形成。
【图文】：

SPATA1/pcDNA3 和 IFT20/GFP 分别或共同转染 CHO 细胞，检测 SPATA1 和 IFT20在细胞内的定位。免疫荧光染色显示，单独转染 SPATA1/pcDNA3 或 IFT20/GFP 时，SPATA1和IFT20呈现为囊泡状分布在细胞质中（图4.2.1，上图）。当 SPATA1/pcDNA3和 IFT20/GFP 共转染 CHO 细胞时，它们部分共定位并聚积在细胞中（图 4.2.1，，下图）。此外，免疫共沉淀验证了 SPATA1 和 IFT20 之间的相互作用。当 IFT20/Flag 和SPATA1/GFP 蛋白表达质粒共转染细胞时，Flag 抗体能同时免疫沉淀 Flag 标记的a b

2小鼠SPATA1和IFT20免疫共沉淀
【学位授予单位】：武汉科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R321.1

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