DENV-2感染的HUVECs和人巨噬细胞相互作用对主要粘附分子表达的影响

发布时间：2020-04-12 14:22

【摘要】：目的:研究登革Ⅱ型病毒(Dengue virus type 2,DENV-2)感染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)和人巨噬细胞,且感染后共培养对主要粘附分子表达的影响。方法:DENV-2感染C6/36细胞,提取细胞RNA,通过RT-PCR扩增DENV-2 NS1部分基因片段,经琼脂糖凝胶电泳检测其扩增产物。不同稀释度的DENV-2病毒液感染C6/36细胞,利用TCID50法计算DENV-2的毒力。水平密度梯度离心法提取浓缩白细胞中的单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC),贴壁分离单核细胞,用巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)刺激后,流式细胞术鉴定细胞表面CD14和CD11b分子。用10~3TCID50 DENV-2分别感染HUVECs和人巨噬细胞,且感染后两者共培养,QPCR(Quantitative PCR)检测细胞内不同时间点DENV-2 NS1、VCAM-1、ICAM-1、E-selectin mRNA相对表达量。双抗体夹心ELISA法分别检测不同时间点各组培养上清液中可溶性分子ICAM-1、VCAM-1、E-selectin的表达水平。结果:经RT-PCR扩增DENV-2 NS1部分基因片段,琼脂糖凝胶电泳后在400-500bp之间出现一明亮条带,证明该病毒是DENV-2。根据TCID50法,DENV-2滴度为10~(-5.5)/0.1ml。流式细胞术测定人巨噬细胞纯度为(92.15±1.24)%。被DENV-2感染的HUVECs其病毒NS1 mRNA的相对表达量呈先增加后降低趋势,在24h(1.25±0.16)达到峰值后逐渐下降;DENV-2感染人巨噬细胞的病毒NS1基因相对表达量呈先递减后增加;共培养组中感染DENV-2的HUVECs的病毒NS1 mRNA各时间点表达水平均高于HUVECs单独感染组。DENV-2感染的HUVECs ICAM-1 mRNA相比未感染组,表达量于4h、72h上调,8h、12h、24h、48h表达量下调;VCAM-1 mRNA相对表达水平呈先增加后减低趋势,且在8h(1.6±0.04,P0.0001)达峰值;E-selectin mRNA相对表达水平呈减低趋势,且在感染后的4h、8h表达量上调,12h、24h、48h、72h表达量下调。DENV-2感染巨噬细胞后ICAM-1 mRNA相对表达量于4h(2.09±0.01,P0.0001)、8h(2.04±0.01,P0.0001)高于未感染组;但未检测到VCAM-1 mRNA的表达。共培养组DENV感染的HUVECs ICAM-1、VCAM-1 mRNA相对表达量与HUVECs单独感染组相比8h后均上调,且均在24h达峰值;感染后的HUVECs E-selectin mRNA于4h(1.20±0.08)表达水平最高,但各组相对表达量均低于共培养组。共培养组中感染DENV-2的HUVECs培养上清液其ICAM-1表达量均高于HUVECs单独感染组;其表达E-selectin随时间呈先递增后降低,且在24h(6.12±1.03)表达量达峰值;但未检测到培养上清液中VCAM-1的表达。结论:DENV-2能在HUVECs和人巨噬细胞中复制且能激活其细胞,被DENV-2感染激活的巨噬细胞能增强被感染的HUVECs的活化并增加其粘附分子的表达。
【图文】：

A：正常 C6/36 细胞；B：细胞融合；C：空泡；D：网格状图 2-1 DENV-2 感染 C6/36 细胞 3-6 天内细胞病变情况（×400）Fig.2-1 Cytopathic effect of C6/36 infected by DENV-2 within 3-6 days (×400)

r；2：DENV-2 NS1 部分序列扩增产物胶电泳鉴定 DENV-2 NS1 部分序列扩增产of DENV-2 NS1 partial gene products by ag 感染后，连续观察 3-6 天，记录不同，根据 Reed-Muench 法计算 DEN。度 DENV-2 感染 C6/36 细胞后出现 CPE 的e CPE of C6/36 cells infected by DENV-2无病变孔数累计 病变孔数 无病变孔数004032000 24 0
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392

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本文编号：2624817