三维培养高传代脂肪干细胞与内皮集落形成细胞治疗慢性放射性溃疡的实验研究

发布时间：2020-04-12 23:27

【摘要】：背景和目的:干细胞是体内一种可以自我增殖、多向分化以及具有强大的旁分泌功能的细胞。而脂肪干细胞因其大量体内脂肪组织来源,其强大的自我增殖及旁分泌能力可应用于临床,治疗多种疾病,例如糖尿病足的难愈性创面[1]。但干细胞经过体外的培养扩增过程中,细胞会出现衰老,形态会发生改变,其增殖分化潜能会明显的降低,并且细胞更容受到外界的环境影响而死亡[2]。这无疑大大影响了细胞的治疗效果。对于提升干细胞治疗潜能的方法有很多,例如人工支架材料[3]、异种生物材料[4]等。这些方法都不可避免的引入了外来材料,或者加入可能对机体有害的化学试剂[5]。本身存在相对更高的治疗成本,更是引入了相对潜在的危险因素,可能对机体造成损害。根据研究团队成员之前的实验发现可以知道,本身存在于细胞外基质中的成分透明质酸可以用于三维的细胞培养[6]。其具有非常安全的生物性能。通过三维培养微球的方式可以增加干细胞的干细胞潜能,细胞的干细胞标志物明显发生上调,细胞存活率大大增加[7],其增殖分化旁分泌功能得到明显提升。同时来自于外周血中的内皮细胞集落形成细胞,其具有非常强的自我增殖潜能。其中高增值潜能的内皮细胞集落形成细胞单个细胞具有集落形成能力。其与脂肪干细胞存在相互作用。一方面可以增加其干细胞潜能。另一方面可以增加脂肪干细胞的存活[8]。本实验的目的在于通过利用透明质酸三维培养经过反复传代后的衰老脂肪干细胞和内皮细胞集落形成细胞构建三维空间结构,从而增加脂肪干细胞的干细胞潜能,减少其在体内过快死亡,增加对疾病的治疗效果。实验方法:1、获取经过反复传代的衰老脂肪干细胞常规用直径3.5mm多侧孔吸脂针对健康女性病人腹部脂肪进行抽脂。将获取的脂肪注入血袋中,在冰水混合物中静置直至血水与上层脂肪明显分层。放出下层血水,留置上层脂肪分装于50ml离心管至一半。加入25ml磷酸缓冲盐溶液到离心管中,充分摇匀后离心机1200g离心3分钟。弃去下层液体,保留中层的脂肪,倒除上层过多的油滴。配置0.075%胶原酶I溶液消化脂肪组织,放置在37度水浴摇床30分钟。用全培中和胶原酶I,离心后去上层油滴和未消化完的脂肪组织,取下层细胞团接种于培养皿上。反复培养至第八代(即为是衰老脂肪干细胞)。2、获取内皮细胞集落形成细胞抽取健康女性外周血20毫升,1:1混合磷酸盐溶液后加入淋巴细胞分离液。低速离心30分钟。取中间白色云雾状细胞层,即血液中的单个核细胞。接种于胶原I铺板的培养皿中直至细胞集落出现。细胞个数约为2000个时传代。3、本课题实验选取的实验动物为裸鼠,自制小型圆柱形铅柱,中间留一缝隙揪出裸鼠皮肤,透明胶带固定。麻醉裸鼠后固定在放射源下,辐照15格雷。静待一个月使裸鼠皮肤发生慢性纤维化,此时用剪出剪出一个7mm的全层皮肤创面。用三维培养后的细胞与对照组治疗创面。对照组划分为:第八代脂肪干细胞、三维培养第八代脂肪干细胞和内皮细胞集落形成细胞、内皮细胞集落形成细胞。4、实验结果三维培养内皮细胞集落形成细胞和脂肪干细胞的组出现类似于血管结构的空间结构,尝试单纯用第八代的脂肪干细胞三维培养存在大量无法形成空间结构的单个细胞,其漂浮于透明质酸中发生死亡。随着创面治疗时间的推移,所有的实验组和对照组创面都趋于愈合。然而,三维培养内皮细胞集落形成细胞和脂肪干细胞的组治疗效果最佳,其余三组之间无明显差异。三维培养组能更好的组织中存活下来,并且参与组成血管结构,而单纯脂肪干细胞组在宿主体内大量被代谢掉仅少量残存在间质中,也未能参与机体组织结构组成。组织的再生情况也明显不如三维培养组。
【图文】：

外周血,干细胞,脂肪,集落形成细胞

逦第一章脂肪干细胞与内皮细胞集落形成细胞的提取１．３实验结果：逡逑Ｋｊｆ：r2邋｜邋ｆ４邋丨逦＜逦，声，，，逡逑＞／－逦．．／Ｖ．逦．？一逡逑＾邋■邋＊．．逡逑－‘邋？．逡逑，ｖ；邋＼ｖ＾ｖｖ＾＾－邋．ｒ邋ｖ，邋，；逦＾逡逑（第三代脂肪干细胞，Ｐ３－ＡＳＣ）逦（第八代脂肪干细胞，Ｐ８－ＡＳＣ）逡逑

三维培养,干细胞,脂肪,浓度

２．２材料与方法逡逑１、我们将根据团队成员以往的透明质酸三维培养经验，准备采取３％的的透逡逑明质酸钠。首先把天平放入超净台中，用酒精擦拭后敞开天平的玻璃门待其自然逡逑风干。用紫外线辐照一小时消毒。先将培养皿放入天平上调零，逐步加入透明质逡逑酸钠粉末，再加入混有１％双抗的培养基。配置浓度稍大于３％邋（算入后续细胞混逡逑悬液体积）。培养箱中静置过夜待透明质酸钠与水充分混匀。逡逑２、将培养的细胞分别加入到培养皿中，３７度培养箱静置过夜。次日收集细逡逑胞用于动物实验、检测。逡逑实验过程中所用到的不同细胞：脂肪干细胞三维培养组、内皮细胞集落形成逡逑细胞和脂肪干细胞混合培养组、脂肪干细胞混悬液、内皮细胞集落形成细胞混悬逡逑液。逡逑２．３结果逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R329.2;R574.62

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