人巨细胞病毒UL146基因编码蛋白vCXCL-1的重组表达及其多克隆抗体的制备和鉴定

发布时间：2020-04-15 14:54

【摘要】：人巨细胞病毒(HCMV)是一种典型的β疱疹病毒,因其在人体内可长期潜伏感染而成为最危害人类健康的病毒之一。HCMV具有多种免疫逃避机制逃避宿主的免疫应答从而在体内传播和扩散。HCMV的UL146基因是HCMV的UL/b’区的一个开放阅读框(ORF),编码一种有助于病毒潜伏和扩散的α趋化因子vCXCL-1。然而由于缺少一些研究工具如vCXCL-1蛋白的抗体,这些分子机制并没有很详细的研究。为了进一步研究vCXCL-1进行免疫逃避的机制,本研究制备了针对vCXCL-1的多克隆抗体,为UL146在HCMV潜伏中所扮演的角色研究提供了有效的工具。本文主要通过原核表达人巨细胞病毒UL146基因编码蛋白vCXCL-1免疫新西兰大白兔的方法来制备多克隆抗体,方法如下:(1)HCMV Towne UL146基因全长的克隆构建:首先以HCMV BAC Towne文库为模板扩增出HCMV Towne UL146基因全长,将UL146全长基因经双酶切插入到原核表达载体pET32a(+)中,将载体与目的片段经T4连接酶连接后导入大肠杆菌DH5α中进行克隆,对构建好的克隆菌提取质粒进行双酶切和测序鉴定。(2)重组质粒的原核诱导表达:将构建成功的重组质粒pET32a(+)-UL146导入到大肠杆菌BL21(DE3)宿主表达菌中加入诱导剂进行诱导表达,优化出重组蛋白在原核细胞中表达的最佳温度、诱导剂浓度和时间,并用Western blot方法分析重组蛋白在原核中的表达形式。(3)重组蛋白的纯化:在优化好的条件下将重组蛋白进行大量诱导表达,分离出菌体经超声破碎后用8 M尿素溶解,将溶解后的蛋白经镍柱分离纯化,并将纯化后的蛋白进行透析除盐,用SDS-PAGE凝胶电泳结合灰度扫描分析纯化后的蛋白的纯度。(4)多克隆抗体的制备及鉴定:以纯化后的蛋白作为免疫抗原,经超滤浓缩和蛋白定量后采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔,获得抗血清,将符合效价的抗血清进行纯化得到纯度较高的多克隆抗体,并用Western blot定性检测多克隆抗体。(5)多克隆抗体的应用:用anti-vCXCL-1兔多克隆抗体作为一抗,用Western blot法检测病毒天然蛋白vCXCL-1在细胞中的表达情况,用间接免疫荧光法检测病毒天然蛋白vCXCL-1在细胞中的定位情况。通过以上方法获得的结果如下:(1)HCMV Towne UL146基因全长的克隆构建:成功从HCMV BAC Towne文库中扩增出HCMV Towne UL146基因全长,将UL146全长基因插入到原核表达载体pET32a(+)的两个限制性酶切位点Sal I和BamH I之间构建克隆,阳性克隆经双酶切鉴定和测序鉴定正确。(2)重组质粒的原核诱导表达:将测序正确的pET32a(+)-UL146重组质粒成功导入至大肠杆菌BL21(DE3)宿主表达菌后,经诱导条件优化,确定重组蛋白在原核细胞中诱导表达的最佳温度为20℃,最佳诱导剂浓度为0.5 mM,最佳诱导时间为10 h,并确定重组蛋白在原核细胞中以包涵体的形式表达。(3)重组蛋白的纯化:重组蛋白经镍柱纯化后经SDS-PAGE凝胶电泳并结合灰度扫描分析出蛋白纯度较高,达80%以上,可用于动物免疫。(4)多克隆抗体的制备及鉴定:免疫后获得的抗血清经ELISA测定,效价达100,000,经Western blot分析,anti-vCXCL-1多克隆抗体可定性检测vCXCL-1重组蛋白。(5)多克隆抗体的应用:经Western blot分析,anti-vCXCL-1多克隆抗体可检测病毒天然蛋白vCXCL-1在细胞中的表达;经间接免疫荧光分析,anti-vCXCL-1多克隆抗体可检测病毒天然蛋白vCXCL-1在细胞中的定位。综上,本实验成功构建pET32a(+)-UL146重组质粒,将其导入BL21(DE3)宿主菌诱导表达,经条件优化,成功获得以包涵体形式存在的高表达量的重组蛋白,重组蛋白经镍柱纯化后获得高纯度的重组蛋白并将其作为免疫兔子的抗原,经数次免疫后获得高效价的抗血清,将抗血清进行纯化获得高质量的多克隆抗体,对获得的多克隆抗体进行定性分析表明成功获得anti-vCXCL-1多克隆抗体,并且该抗体可用于检测病毒天然蛋白vCXCL-1在细胞中的表达和定位。
【图文】：

病毒结构,浮力密度

暨南大学硕士学位论文第一章绪论细胞病毒概述细胞病毒（HCMV）是一种广泛存在于人体内的双链 DNA 病毒毒家族，具有种属特异性。HCMV 于 1956 年首次从唾液腺中分粒子结构如图 1 所示，该病毒颗粒直径约 230 nm，衣壳成二十面约 100 nm，由含 150 个六邻体及 12 个五邻体的壳粒构成，包膜（1一层皮层（厚约 50 nm）隔开。HCMV 的浮力密度（1.716 g/cm3细胞 DNA 浮力密度。

基因组结构,病毒株

株是低传代临床株，在 HFF 细胞中可传代次数较少。Dolan 等人对其基因组测序发现，Merlin 株基因组大小为 235645 bp，其中 UL 大小为 193019 bp, US 大小为35481 bp，RL 大小为 1324 bp，RS 为 2537 bp[4]。与 Merlin 株相比，AD169 株在基因组结构上有突变。AD169 株与 Toledo 株相比缺失了一段 15 kbp 的片段[3]。Towne 株属于高传代株，野生型的 Towne 株与 Toledo 株相比缺失了约 13 kbp 的片段[3]。Andrew Marchini 等人将 HCMV Towne 株进行了细菌人工染色体（BAC）克隆，并将其分别转化于大肠杆菌及转染于 HFF 细胞中并测定其产生噬菌斑的能力，结果表明他们成功构建了带有 GFP 标签的 HCMV Towne 的 BAC（T-BACwt DNA），且与野生型的 Towne 株相比它们之间的感染能力没有明显差别[6]。随即，Walter Dunn 等人对 T-BACwt DNA 采用鸟枪法进行测序分析（如图 2）发现，该 TowneBAC最少编码 162 个 ORFs，同样，Towne 株由 UL 和 US构成，，两侧存在反向重复序列 RL 和 RS。他们的研究还发现有 45 个 ORFs 对于HCMV 在 HFF 中的复制是必须的而另外 117 个 ORFs 是非必需的[7]。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R373

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