结核分枝杆菌内膜蛋白Rv3882c跨膜结构域的动力学与结构研究

发布时间：2020-04-15 15:32

【摘要】：结核病(Tuberculosis)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tubercuulosiis)感染引起的传染性疾病,对人类的危害十分严重,已成为第二大致死性传染病,每年造成约200万人死亡。已发现的结核分枝杆菌分泌系统有SecAl、SecA2、Tat、ESX共四种,其中ESX分泌系统最初是在分泌蛋白ESAT-6和CFP-10的分泌过程中发现的,它一般转运缺少传统信号肽序列的蛋白质,与毒力和致病性密切相关。ESX分泌系统共包含5个相互独立的分系统,分别为ESX-1、ESX-2、ESX-3、ESX-4及ESX-5。ESX-1分系统参与细菌入侵宿主细胞和机体调控的防御过程,是目前研究最多的分系统。在此分泌系统的组成蛋白中,由rv3882c基因编码的MtRv3882c蛋白(EccE蛋白),是ESX-1分泌系统中一个保守的组分。但目前为止,仍没有结构与功能明确的同源蛋白质三级结构,因此无法了解Rv3882c蛋白的三级结构,也就无法了解其在机体中扮演的角色与功能。目前酵母双杂交实验证实MtRv3882c会与胞质蛋白MtRv3614c相互作用形成异源复合物促进相关分泌蛋白的分泌,同时也有研究称MtRv3882c蛋白是与其他几种ESX系统保守蛋白(EccB、EccC、EccD)结合在一起构成大的膜蛋白复合物(约1.5 MDa),形成底物迁移通道(transloaction channel)促进物质分泌。本课题中我们采用大肠杆菌表达系统,表达纯化MtRv3882c-TM(跨膜区)的单突变体及双突变体蛋白,获取状态均一、纯度较高的目的蛋白。然后结合位点特异性自旋标记与电子顺磁共振技术,探究MtRv3882c蛋白跨膜结构域的结构特征。在去污剂胶束载体环境下,通过电子顺磁共振技术获取标记后的跨膜结构域的运动性、易趋性及距离测量等信息,判断起止位点、二级结构特征以及跨膜螺旋的取向信息,综合得出MtRv3882c-TM的结构模型。通过CW-EPR实验我们获取了跨膜区位点侧链的AH-1和H2-1以及谱宽Azz值等动力学参数,去污剂胶束中跨膜区位点侧链的动力学参数均高于无规卷曲的值,这表明跨膜螺旋区位点的运动性更低,无规卷曲处位点的运动性更高。同时通过功率饱和实验测量Mt0082蛋白在去污剂胶束中的易趋性信息,分析出位点35到54的ΠNiEDDA值保持在一个较低的水平,即这些位点所在的区域疏水性较强;ΠIo2值的结果表明位点35到54的值保持在一个很高的范围,然后结合Φ值的变化情况来看,跨膜区及其两侧序列总体呈现出一种“亲水-疏水-亲水-疏水-亲水”的交替变化模型。通过我们的研究,将为MtRv3882c蛋白结构与功能提供依据。同时,本课题也为拓展SDSL-EPR技术在膜蛋白研究中的应用提供思路与方法。
【图文】：

示意图,电子能级,磁场,外磁场

于外磁场Ｂ0时，会产生两种取向的自旋磁矩：自旋磁矩方向与外磁场反向平行逡逑（Ｍｓ邋＝邋＋ｌ／２），此时电子处于较高能级；另一种与外磁场正向平行（Ｍｓ＝－ｌ／２），这逡逑时电子会处于较低能级。图１．１所示的为电子在外磁场中存在两种不同能级的逡逑不意图：逡逑１逡逑

示意图,光谱仪,波段,示意图

Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆＸ－ｂａｎｄ邋ＥＰＲ邋ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ逡逑一套完整的电子顺磁共振谱仪是由磁场系统、微波系统、谐振腔、调制系统、逡逑检测系统及计算机系统等部分组成的。图１．２所示的是标准Ｘ波段ＥＰＲ光谱逡逑仪示意图。图中左测为一种速调管或者耿氏二极管的微波源，用于输出２００邋ｍＷ逡逑恒定或１０％的可调谐频率。其产生的辐射通过矩形空心波导管传输到衰减器中，逡逑通常在衰减器中２００邋ｍＷ的功率可以降低丨到１０６倍。衰减器的输出辐射通逡逑过波导管继续传输到循环器，循环器使微波进入下行传导到达包含样本的谐振器。逡逑在微波进入谐振器之前，遇到了虹膜，这是一种调节从谐振器反射回来的辐射量逡逑的装置。反射的辐射返回到循环器，然后被强迫进入右边的波导进入一个二极管逡逑来检测微波强度。而从探测器反射回来的剩余辐射都被循环器强迫进入向上波导，逡逑该向上波导以楔形、锥形或“扼流圈”的形式结束并转化成热量，，这样就不会有逡逑辐射返回到微波源。在衰减器进入包含可关闭端口的参考臂波导之前
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R378.911

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