表皮葡萄球菌VraR蛋白的原核表达及其生物学功能研究

发布时间：2020-04-15 19:13

【摘要】：研究目的分析表皮葡萄球菌SE1457 VraSR生物信息学特点,并原核表达表皮葡萄球菌SE1457反应调节蛋白VraR,检测表皮葡萄球菌SE1457 vraSR敲除突变株(ΔvraSR)的生物学表型,结合转录组测序初步探索VraSR在表皮葡萄球菌生物膜形成和药物敏感性中的作用,为后续具体研究VraSR在表皮葡萄球菌生物膜形成中的分子机制奠定理论基础,这对临床上有效预防和控制表皮葡萄球菌生物膜感染具有重要意义。研究方法1.从NCBI数据库中获取表皮葡萄球菌标准株SERP62A(ATCC35984)基因组序列,设计引物,以表皮葡萄球菌SE1457基因组为模板,PCR扩增vraSR基因片段(重复3次),测序获得SE1457 vraSR基因序列,通过生物信息学分析常用软件对SE1457 VraSR的基因序列特点、氨基酸特点、结构域特点进行分析。从GenBank数据库中获取其它细菌VraS/vraR类似物的遗传信息,包括金黄色葡萄球菌(S.aureus USA300、S.aureus Col、S.aureus Newman、S.aureus Mu50、S.aureus MW2)、枯草杆菌(Bacillus subtilis substr 168)、变异链球菌(Streptococcus mutans substr UA159)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis substr MG1363),利用Vector NTI和DNAMAN软件对SE1457 VraS/vraR与其它细菌类似物的核苷酸和氨基酸序列进行比对和进化树分析,以比较它们的同源性。2.表皮葡萄球菌SE1457 VraR蛋白的表达:PCR扩增表皮葡萄球菌SE1457vraR基因(630 bp),酶切后连入载体pET28a,构建重组质粒pET28a-vraR,重组质粒转入大肠杆菌BL21。通过摸索不同表达温度(37℃、28℃、22℃、16℃)和不同IPTG诱导剂浓度(0.5 mM、0.8 mM、1.0 mM、1.5 mM)对重组蛋白6His-VraR进行表达,以确定最佳表达条件。3.表皮葡萄球菌SE1457及其vraSR敲除突变株的生物学表型研究:分别采用纸片弥散法和试管稀释法检测了表皮葡萄球菌SE1457野生株和ΔvraSR突变株对常用抗生素(万古霉素、氨苄青霉素、青霉素G、卡那霉素、氯霉素、四环素、左氧氟沙星)的药物敏感性。微量平板法检测表皮葡萄球菌SE1457及其vraSR敲除突变株6h、12h、24h和48h生物膜形成量(OD570)。4.转录组测序分析:表皮葡萄球菌SE1457野生株和ΔvraSR突变株经1:200稀释于TSB培养基,37℃培养6h后收集细菌,抽提RNA,经鉴定后送公司测序(上海伯豪生物技术有限公司),每样品3次重复。研究结果1.vraS基因(基因座位serp1423)含有1047 bp,编码348个氨基酸,vraR基因(基因座位serp1422)含630 bp,编码209个氨基酸,两者间有11 bp重复序列;vraSR上游有两个开放读码框serp1425与serp1424,其中SERP1424与vraS有4个碱基是重叠的,在其下游有一反向重复序列结构。表皮葡萄球菌VraSR与其他细菌类似物具有高度同源性,与金黄色葡萄球菌VraSR同源性高达90%,与变异链球菌和乳酸乳球菌类似物同源性为50-70%,与枯草杆菌类似物同源性为50%。表皮葡萄球菌SE1457中VraS蛋白为胞膜蛋白(1047bp,编码348aa),有四个结构域,跨膜区(TM)氨基酸的疏水值高达4.0;反应调节蛋白VraR为胞浆蛋白(630bp,编码209aa),有两个结构域,含有HTH结构域(Helix-turn-Helix基序),能够与下游的靶基因启动子区DNA结合。2.经酶切、PCR及测序鉴定,成功构建重组表达质粒pET28a-vraR。在22℃,0.5 mM IPTG过夜诱导下,重组蛋白6His-VraR的表达量较理想。3.纸片弥散法结果显示,表皮葡萄球菌SE1457对上述7种药物的敏感性(抑菌圈)分别为15±0.5 mm、40.2±2.1 mm、45.3±2.6 mm、32.4±0.82 mm、27.6±0.66mm、34±1.32 mm、34.5±1.0 mm;ΔvraSR突变株对上述7种药物的敏感性(抑菌圈)分别为19±0.54 mm、43.5±1.8 mm、49.6±1.9 mm、33.5±0.79 mm、28.5±0.79 mm、34.9±2.18 mm、34.8±0.99 mm。试管稀释法结果显示,SE1457野生株对上述6种药物的敏感性(MIC值)分别为4μg/mL、0.5μg/mL、0.5μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、0.5μg/mL;ΔvraSR突变株对上述药物的敏感性(MIC值)分别为1.0μg/mL、0.25μg/mL、0.25μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、0.5μg/mL。4.微量平板法检测表皮葡萄球菌生物膜形成情况,SE1457野生株在上述四个时间点生物膜形成量(OD_(570))分别为1.52±0.09、2.13±0.27、2.55±0.05和2.67±0.19;ΔvraSR突变株生物膜形成量分别为0.72±0.02、0.95±0.06、1.23±0.23和1.41±0.21;SE1457野生株和ΔvraSR突变株生长无明显差异。5.转录组测序发现有73个基因差异表达,其中有58个基因转录水平下调,15个基因转录水平上调,差异表达的基因主要涉及于糖代谢,磷酸盐代谢,细胞壁合成,全局调节子等,而与耐药性直接相关的基因(pbp2,murZ,sgtB等)转录水平未发现有统计学意义。研究结论1.在表皮葡萄球菌SE1457双组分系统中VraSR,VraS为感受器,VraR为反应调节蛋白,其编码的基因vraSR可能与上游2个基因serp1424和serp1425共同形成一个更大的操纵子。2.重组蛋白6His-VraR表达的最佳条件为:IPTG诱导剂浓度为0.5 mM,表达温度为22℃,诱导过夜(约12 h)。3.表皮葡萄球菌ΔvraSR突变株对作用于细菌细胞壁的药物(万古霉素、氨苄青霉素、青霉素G)敏感性较野生株SE1457增高,而对其它作用机制药物的敏感性与SE1457野生株相比差异无显著性。ΔvraSR突变株的生物膜形成能力较野生株SE1457显著降低。转录组测序结果提示,表皮葡萄球菌VraSR不直接参与药物敏感性的调控,可能是通过调节细胞壁的完整性,糖和蛋白的代谢来影响表皮葡萄球菌生物膜的形成和药物敏感性。
【图文】：

vraSR 基因座位，粗体字母为操纵子基因之间的间隔序列或重复序列，，下划线为起始终止密码子。图 1.1 表皮葡萄球菌 SE1457 vraSR 基因序列特点分析 表皮葡萄球菌 SE1457 VraS/VraR 氨基酸序列特点

性为52%-70%，它们与表皮葡萄球菌VraSR核苷酸序列同源性为50%-60%，氨基酸序列同源性为30%-50%，聚为第三类；枯草杆菌单独为一类，它与表皮葡萄球菌VraSR的同源性约50%（表1.1，图1.2）。
【学位授予单位】：大理大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R378.11

【参考文献】

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1 叶联华;黄云超;杨达宽;李莉;许赓;赵光强;马千里;陈安宁;;聚氯乙烯材料表面细菌生物膜结构观察[J];生物医学工程与临床;2007年04期

本文编号：2628886