表观酶Tet2促进感染诱导髓系发生及其转录后机制研究

发布时间：2020-04-16 01:12

【摘要】：表观转录组学(Epitranscriptome)是生命科学领域新兴的前沿研究热点,主要关注各种RNA水平的修饰,及其在细胞转录组中的分布和表观调控作用,如近年来被广泛研究的6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)。5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)修饰在生理状态下存在于包括mRNA的多种RNA中。然而作为一种可逆的化学修饰,其动态调控机制还不清楚,特别是还没有发现其特异性的去甲基化酶。另外,作为一种在哺乳动物RNA中普遍存在的修饰方式,其生理和病理功能尚不清楚,特别是其在基因表达调控中的功能尚有待于深入研究。研究mRNA中5-mC的调控及其功能是表观转录组的一个重要方向。Tet蛋白(Ten-eleven Translocation,Tet)作为DNA甲基化的氧化酶,也能够在体外氧化RNA中5-mC。Tet蛋白是否在哺乳动物细胞中调控mRNA中的5-mC修饰,其在不同的生理过程中发挥着怎样的调控作用?这些科学问题有待进一步研究。天然免疫是抵御病原体的第一道防线,如何快速高效的识别和清除病原体,并维持免疫稳态,是天然免疫的根本科学问题。病原体感染激活免疫系统,诱导炎症反应,产生各种细胞因子进一步动员造血干细胞向髓系细胞分化,放大天然免疫应答效应是机体快速清除病原体的重要手段。髓系发生(Myelopoiesis)是急性或慢性感染的关键应答反应,其表观遗传学机制尚未见报道,值得探究。Tet2不仅在造血干细胞的自我更新和分化中发挥着重要的调控作用,多项研究也发现Tet2在造血系统多种恶性肿瘤中存在多位点突变,且Tet2基因突变导致的催化功能缺失与造血系统恶性肿瘤的发生发展密切相关,特别是在髓系恶性肿瘤中,表明Tet2可能是一种重要的抑癌基因。此外,Tet2在炎症消退过程中也发挥着重要的调控作用。Tet2是否也参与病原体感染诱导的髓系免疫细胞分化还有待研究。本课题围绕Tet2是否参与感染诱导的髓系发生及其表观调控机制展开研究。我们发现,Tet2能够通过抑制Socs3的mRNA水平而促进脓毒症感染和寄生虫感染诱导的髓系免疫细胞的分化扩增。Tet2通过Adar1抑制Socs3的表达,Adar1通过结合双链RNA并以RNA编辑非依赖的方式降低Socs3 mRNA的稳定性。进一步机制研究发现Tet2抑制了mRNA上5-mC的水平,Tet2缺失导致Socs3 mRNA 3′-UTR区域5-mC水平上升,可能通过5-mC特异性的结合蛋白影响该区域RNA双链的形成,从而减少Adar1的结合。本研究揭示了DNA甲基化氧化酶Tet2分子能够促进感染诱导的髓系天然免疫细胞的发生,从而促进机体对病原体的抵抗能力,为机体抵抗病原体感染的效应机制提出了新观点,也为有效防治感染性疾病提供了新思路和潜在药物研发靶标。同时,Tet2一直被认为是通过调控染色质状态来介导基因转录水平的调控,而本研究首次提出了Tet2作为RNA结合蛋白能够在mRNA修饰水平参与转录后调控的全新功能,为进一步研究Tet2的生理病理功能开辟了新的研究方向。第一部分Tet2通过抑制Socs3的表达而促进感染诱导的髓系免疫细胞分化在病原体感染过程中,机体需要从骨髓大量动员免疫细胞到外周血,以快速高效地清除入侵的病原体。同时,刺激造血的细胞因子以及炎性细胞因子促进了更多髓系细胞的发生。为了观察Tet2在此过程中的作用,我们首先构建了盲肠结扎穿孔诱导脓毒症的小鼠模型,发现Tet2缺失显著降低小鼠脓毒症CLP模型的死亡率和临床评分,其原因主要是Tet2缺失使得髓系终末细胞的动员显著降低而避免了炎症因子风暴导致的组织器官损伤;另外我们还构建了血吸虫感染(慢性感染模型)诱导肥大细胞分化扩增的模型,发现Tet2缺失也能够抑制寄生虫感染诱导的肥大细胞的分化。说明Tet2在病原体感染诱导的髓系细胞分化中起着关键作用。为了进一步探究Tet2促进髓系发生的分子机制,我们对野生型和Tet2敲除的骨髓来源的肥大细胞进行了表达谱分析,发现PI3K-AKT和JAK-STAT信号通路的多个基因在Tet2缺失细胞中表达有显著变化,其中包括JAK-STAT信号通路的关键抑制分子Socs3。进一步检测发现Tet2敲除的造血祖/干细胞和肥大细胞中IL-3诱导的Socs3 mRNA和蛋白水平显著增高,并且Tet2敲除细胞中,IL-3信号通路活化障碍,STAT5和AKT的磷酸化水平降低。而在Tet2敲除的细胞中通过siRNA沉默Socs3的表达后,IL-3信号通路活化水平有所恢复。这些结果提示Tet2通过抑制Socs3的表达,从而促进IL-3等细胞因子信号通路的活化,这可能是Tet2促进病原体感染诱导髓系免疫细胞发生的关键机制。第二部分Tet2通过Adar1在转录后水平抑制Socs3的表达进一步研究Tet2抑制Socs3表达的分子机制,我们发现Tet2抑制Socs3的表达并不是通过调控Socs3基因区的DNA甲基化水平,而是在转录后水平。这一结果提示了Tet2作为一种RNA结合蛋白可能具有广泛的转录后调控功能。我们通过构建紫外交联免疫共沉淀结合高通量测序体系,在全基因组范围内寻找Tet2结合的靶RNA分子。结果发现Tet2结合的RNA种类中,80%属于已知基因转录的mRNA,其中包括Socs3的3′-UTR区域。同时在RNA-seq数据中,我们发现野生型对照组中A-to-G突变的数目显著高于Tet2敲除组,且更多富集于mRNA的3′-UTR区。Socs3 mRNA的3′-UTR区域也包含A-to-G突变位点。Adar1结合双链RNA并介导A-to-I编辑,提示Adar1可能参与这些位点的编辑。在野生型细胞中干扰Adar1后Socs3表达上升,但报告基因结果显示Adar1对Socs3的调控不依赖其酶催化活性。有文献报道Adar1能够其他RNA结合蛋白在转录后水平调控基因表达,而不依赖其RNA编辑功能。我们通过免疫共沉淀联合质谱检测发现,Adar1能够与调控mRNA稳定性的RNA结合蛋白结合,可能通过这些蛋白发挥抑制Socs3的功能。通过进一步探究Tet2在Adar1介导的Socs3抑制功能中的作用,我们发现在Tet2敲除细胞中干扰Adar1不能升高Socs3的表达,结合过表达实验发现,Tet2以酶活性依赖的方式促进Adar1对Socs3表达的抑制作用,而同时又不依赖于其DNA结合功能。第三部分Tet2通过抑制mRNA中5-mC的水平而参与Socs3的转录后抑制Tet2能将DNA上的5-mC催化氧化成为5-hmC,同时,RNA上的5-mC修饰也被发现存在果蝇和人类细胞系中。为了研究Tet2能否通过氧化的方式降低mRNA中5-mC,我们构建了Tet2体外催化体系,通过质谱和点杂交检测发现Tet2能够在体外和体内以底物依赖的方式降低mRNA上的甲基化修饰水平,并且在Tet2敲除细胞中,我们发现mRNA上的5-mC修饰水平升高。而野生型细胞中胞嘧啶上的其他甲基化氧化修饰5-hmC、5-fC和5-caC的含量则很低。通过建立RNA甲基化组分析,发现在mRNA上存在5-mC修饰,且在Tet2敲除细胞中5-mC水平显著升高。以上结果说明Tet2能够以氧化依赖的方式抑制mRNA上5-mC的水平。进一步实验发现5-mC的存在能够抑制Adar1与其靶RNA的结合。DNA或者RNA的修饰能够招募特异性蛋白发挥表观调控功能,通过RNA 5-mC结合蛋白实验分析,发现5-mC能够结合一些ATP依赖的RNA解旋酶,这些蛋白跟RNA二级结构的改变和双链解旋有关,而Adar1结合双链RNA。以上结果说明mRNA上的5-mC修饰能够抑制Adar1功能,可能是通过抑制双链RNA的形成使Adar1结合减少的原因。综上所述,Tet2能够通过氧化依赖的方式降低mRNA上5-mC修饰的水平,Tet2的缺失使mRNA上5-mC修饰的水平升高,从而抑制Adar1的功能。我们发现Tet2可能通过抑制5-mC水平促进双链RNA的形成,而双链RNA是Adar1结合所必需的。结合野生型和Tet2敲除细胞中转录组突变位点的对比分析,我们也揭示了Tet2和Adar1功能上的广泛联系。此外,我们还发现,内源性mRNA上5-hmC的数量远远少于5-mC,说明从5-hmC如何转换为未甲基化的胞嘧啶需要其他的酶或者更多催化步骤。Tet2在转录后水平降低JAK-STAT信号通路的关键负调控分子Socs3的mRNA的稳定性,维持了细胞因子如IL-3信号通路的持续活化,促进了病原体感染诱导的髓系天然免疫细胞的分化,为抗感染免疫的表观调控提供了新的机制。
【图文】：

三、结果（一）Tet2 缺失降低脓毒症引起的髓系天然免疫细胞发生我们首先构建了小鼠盲肠结扎穿孔（CLP）模型。当小鼠发生盲肠穿孔菌的肠内容物持续漏入腹腔引起感染，首先诱发腹膜炎，导致肠道细菌循环，激活免疫系统诱发全身炎症反应，这一过程中也触发骨髓内髓系细胞的动员，如中性粒细胞和单核细胞分化以有效清除病原体。同时，免疫细胞的模式识别受体（PRRs）会识别细菌的病原体相关分子模式（动炎症反应，分泌大量炎性细胞因子和趋化因子，进一步激活和招募各胞，放大炎症反应。而炎症反应会导致组织和器官损伤，而释放胞内的损伤相关分子模式进一步活化免疫细胞，再次放大炎症反应。过度的炎炎性细胞因子风暴，导致内毒素休克，甚至机体死亡。我们发现，与对照组小鼠相比，，Tet2 敲除小鼠在该模型中死亡率和临床低（图 1-1A，B），表明 Tet2 敲除小鼠脓毒症的严重程度与对照小鼠比更造模 24 小时内，腹腔和外周血中早期的细菌数量在 Tet2 敲除小鼠和野生间没有显著差异（图 1-1C）。

缺失减弱败血症引起的髓系发生动员educed emergency myelopoiesis in Tet2-deficient mice in abd of Tet2-deficient (KO) and the littermate control (WT) micB) Cell enumeration (n = 6). (C) Levels of cytokines in serubiologically independent mice).**P < 0.01, Unpaired two-sided Student’s t-test, mean and siologically independent animals.et2 促进寄生虫感染诱导的肥大细胞分化扩失是否影响病原体慢性感染诱导的髓系免疫细胞扩增？带小鼠寄生虫感染模型，检测 Tet2 是否影响寄生虫感染诱发骨髓造血干细胞来源的肥大细胞广泛分布于粘膜组织中，现肥大细胞不仅是 IgE 介导的速发型变态反应的效应细胞和招募炎性细胞，近年来的研究对其在感染性疾病中的作关注。我们利用缺失肥大细胞的 kitw-sh/w-sh小鼠构建肠道寄
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

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本文编号：2629216