肺炎克雷伯杆菌裂解性噬菌体Kp-8329的分离鉴定和基因组分析

发布时间：2020-04-21 00:48

【摘要】：肺炎克雷伯杆菌(klebsiella pneumoniae)属于肠杆菌科,克雷伯氏菌属,在健康人的呼吸道和肠道正常菌群中均可存在,一般情况下不致病,其发病与宿主的防御功能缺陷、菌群失调及多种诱发因素相关。肺炎克雷伯杆菌是一种条件致病菌,其易感人群主要包括新生儿、老年人、免疫低下宿主、糖尿病病人、肿瘤患者,当机体的免疫力下降或者在创伤、手术等其他诱因下,极易引发细菌感染,从而出现一系列临床症状。肺炎克雷伯杆菌易引起肺炎,还可以引起脑膜炎、肝脓肿、泌尿道感染、伤口感染。近年来,随着广谱抗生素的滥用,肺炎克雷伯杆菌已经对多种抗生素产生耐药性,导致临床抗生素治疗失败以及病情迁延不愈。噬菌体由于其生物学特性,成为治疗感染的有效手段之一,现已广泛应用于多个领域。本实验以吉林大学第二医院分离得到的多重耐药肺炎克雷伯杆菌作为宿主菌,通过双层琼脂平板法从医院污水中分离出裂解性噬菌体,命名为Kp-8329,并对其生物学特性做初步鉴定:(1)透射电镜显示,噬菌体Kp-8329为有尾噬菌体目、长尾病毒科噬菌体,头部直径约45~50nm,有一条尾,直径约130-140nm;(2)Kp-8329基因组为双链DNA,基因组含有EcoR I,EcoRⅤ,Hind III,Nde I等酶切位点;(3)Kp-8329的最佳感染复数(MOI)为0.01;(4)一步生长曲线显示,Kp-8329有15分钟的潜伏期,爆发期持续15分钟,爆发量为147PFU/cell;(5)在pH 5-12的范围内和60℃以下的温度范围内,Kp-8329依然有较高的活性和裂解率;(6)Kp-8329裂解率较高,19株肺炎克雷伯杆菌临床分离株可高效裂解其中的12株,裂解率为63.16%。(7)基因组测序和全基因组序列分析表明,Kp-8329基因组长度为46,907 bp,GC含量为46.90%,含有116个开放阅读框,其中32个可预测其功能。基于DNA聚合酶亲缘关系进化树表明,噬菌体Kp-8329与大肠埃希菌属噬菌体Escherichia phage vB EcoS Sa179lw在同一个分支上,有较近的进化关系。噬菌体Kp-8329的全基因组序列已提交至GenBank,其登录号为:MK327140.1。综上所述,本研究筛选出一株肺炎克雷伯杆菌毒性噬菌体Kp-8329,其裂解率高、适应性强。不携带毒力基因与耐药基因,为研发噬菌体生物制剂,以用于治疗临床多重耐药菌感染提供了新的思路。
【图文】：

至溴酚蓝超过分离胶下缘后断电。（5）取出凝胶板冲洗，打开玻璃板，切去目的区域的凝胶，再冲洗片刻后将其浸泡染液内 30 分钟。（6）将染过色的凝胶进行脱色，放于脱色摇床上脱色，，期间定时更换容器内脱色液至可见清晰不同颜色的蛋白条带即可，拍照记录结果。2.3 结果2.3.1 肺炎克雷伯杆菌噬菌体的分离纯化及滴度测定以肺炎克雷伯杆菌 Kp-8329 为宿主菌，从吉大一院医用废水中分离得到一株裂解性菌体，将其命名为 Kp-8329。如图 2.1 所示，噬斑呈圆形，直径约 3~5mm，边缘清晰，小均一，在噬斑周围有一个半透明的晕环，宽度约 5mm，显示出裂解性噬菌体的噬斑特征当噬菌体浓低至一定程度时会出现单个噬斑。

第 2 章 肺炎克雷伯杆菌的分离鉴定及生物学特性es of Klebsiella pneumoniae bacteriophage increasing the dilution multiple of figure A电子显微镜观察329 在透射电子显微镜下观察，如图 2.2 所成，头部直径约为 45-50nm，有一条尾约audovirales Order）、长尾病毒科（Stylovir
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R378

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本文编号：2635159