发热伴血小板减少综合征病毒基因组及其包膜蛋白Gn-Gc的研究

发布时间：2020-04-23 01:39

【摘要】：目的分离和鉴定发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)病毒株系,获得全基因组序列信息以及鉴定病毒基因型。重组表达SFTS病毒包膜蛋白Gn-Gc,构建SFTS病毒包膜蛋白Gn-Gc表达载体,实现包膜蛋白Gn-Gc可溶性表达。方法1、采集14例浙江省SFTS病毒标本,利用Vero细胞培养并分离病毒,提取病毒核酸并鉴定。2、对其中3株病毒分别采用随机引物建库法和oligo(d T)磁珠抓取RNA建库法进行建库,利用NGS测序平台检测病毒核酸序列,将测序结果进行比较后,建立针对SFTS病毒的建库方法。3、对14株病毒进行高通量测序,将病毒S、M和L片段序列与Gen Bank上40株不同SFTS病毒基因型序列构建系统进化树并分析。4、根据SFTS病毒Gn-Gc基因序列,截取3126个蛋白编码碱基,插入到载体p ET-His中,转化到BL21(DE3)感受态细胞中表达并纯化。5、通过SDS-PAGE电泳和Western-blot方法验证表达的目的蛋白。结果1、采集的14例标本盲传3代,第3代时培养至第5天细胞出现病变,7天后细胞脱落。提取病毒核酸进行荧光定量RT-PCR,Ct值均小于35,为阳性。2、oligo(dT)磁珠抓取建库法相比随机引物建库法,具有更大的优势。随机引物建库法的测序深度和覆盖度均低于oligo(d T)磁珠抓取建库法,且后者测序深度在900以上,覆盖度超过99%。将测序获得的3例标本基因组序列与参考株序列比对,与NCBI上基因组序列平均匹配率约为94.5%。3、将测序获得的14株病毒序列与Gen Bank上不同基因型的序列构建系统进化树,发现所有标本被分为两种病毒基因型,D型和E型。4、构建了表达载体p ET-His-Gn-Gc,提取的重组质粒和酶切片段经琼脂糖凝胶电泳显示与测序结果相一致。5、表达的重组蛋白Gn-Gc理论大小约为100k Da,SDS-PAGE电泳结果显示在100k Da附进出现明显条带。Western-blot检测结果显示在100k Da附近出现一条明显主带。结论建立了针对SFTS病毒的高效、特异的高通量测序建库方法,并对近几年浙江省SFTS病毒毒株进行了测序分析和分型。成功构建了可溶性表达SFTS病毒表面蛋白Gn-Gc的载体,建立了稳定的Gn-Gc表达、纯化体系,为后续研究SFTS病毒包膜蛋白结构和功能奠定了基础。
【图文】：

(A)正常 Vero 细胞；(B)接种病毒培养 5 天细胞出现 CPE图 1 SFTS 病毒接种 Vero 细胞产生病变表 5 14 例标本信息和 Ct 值编号 性别 年龄 地区 职业 年份 Ct 值

核酸毛细管电泳分析
【学位授予单位】：浙江中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R373

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本文编号：2637211