人3、7和55型腺病毒三价疫苗候选株及纤毛蛋白嵌合型重组人3型腺病毒的研究

发布时间：2020-04-23 09:21

【摘要】：【目的】人类腺病毒(HAdV)3、7和55型可引起急性呼吸道疾病流行和暴发。1、研究并探讨一株抗人3、7和55型腺病毒三价疫苗候选株,为腺病毒疫苗研究奠定基础。2.鉴定中和抗原对监测疫情和疫苗开发至关重要,以人三型腺病毒为基础,构建7型腺病毒纤毛头和六邻体蛋白嵌合型重组腺病毒,研究产生主要中和抗体的抗原。3、构建人5型腺病毒纤毛蛋白嵌合型重组人三型腺病毒,研究其对类动物细胞的感染性。【方法】一、通过同源重组,将含有HAdV-55六邻体的片段pSKE3LR-h55中的HAdV-55六邻体(h55)重组到含有HAdV-3和HAdV-7六邻体的质粒p BRAd-MHE3中,得到的三价腺病毒质粒命名为p BRAd-MHE3-h55。在二价疫苗rAdMHE3的E3区表达HAdV-55的六邻体,包装出重组抗人3、7和55型腺病毒三价疫苗候选株rAdMHE3-h55。测定重组腺病毒的生长曲线用来分析其生长特性,使用小鼠血清对重组病毒进行的体外中和试验。使用rAdMHE3-h55免疫小鼠,分别用HAdV-3、HAdV-7和HAdV-55滴鼻攻毒,取肺组织进行Q-PCR检测、HE染色,检测重组腺病毒对小鼠的保护力。通过PCR扩增人7型腺病毒的纤毛头基因,与人3型腺病毒载体进行同源重组,包装出含Ad3E骨架和HAdV-7纤毛头的重组衣壳嵌合人腺病毒rAd3E-Fk7。通过PCR获得的人7型腺病毒的六邻体基因替换p Ad3E-Fk7的3型六邻体,包装出含有Ad3E骨架和HAdV-7六邻体和纤毛头的重组衣壳嵌合人腺病毒rAd3E-H7Fk7。测定重组腺病毒的生长曲线用来分析其生长特性,使用小鼠和人血清对嵌合腺病毒进行的体外中和试验。使用纯化的病毒HAdV-3、HAdV-7和rAd3E-H7Fk7免疫小鼠获得血清进行体外中和实验,在人血清中对重组腺病毒进行中和试验。三、通过PCR扩增人5型腺病毒的纤毛头基因,与人3型腺病毒载体进行同源重组,包装出包含Ad3E骨架和HAdV-5纤毛头的重组衣壳嵌合人腺病毒rAd3E-Fk5。测定重组腺病毒的生长曲线用来分析其生长特性。重组人腺病毒rAd3E-Fk5感染小鼠原代肾上皮细胞、金仓鼠原代肾上皮细胞以及测定rAd3E-Fk5在金仓鼠原代细胞内晚期基因的表达。【结果】一、成功包装出了重组抗人3、7和55型腺病毒三价疫苗候选株rAdMHE3-h55。重组三价病毒rAdMHE3-h55表达HAdV-55的六邻体蛋白并且具有与其对应的野生型HAdV-3有相似的复制动力学。小鼠抗-rAdMHE3-h55对HAdV-3、HAdV-7、HAdV-55和rAdMHE3-h55产生强应答,而小鼠抗-HAdV-55仅针对HAdV-55和rAdMHE3-h55的产生应答。这些发现证实,重组腺病毒rAdMHE3-h55能够在小鼠中诱导免疫应答,并且产生针对HAdV-3、HAdV-7和HAdV-55的抗体。用rAdMHE3-h55接种可BALB/c小鼠,使用HAdV-3、HAdV-7和HAdV-55对其进行滴鼻感染,发现第五天,免疫后的小鼠对三种病毒都能有效的清除。我们的体外和体内研究表明,rAdMHE3-h55不仅能够诱导针对HAdV3、HAdV7和HAdV55的中和抗体,而且使用HAdV-3、HAdV-7或HAdV-55对小鼠进行滴鼻攻毒,rAdMHE3-h55免疫对小鼠能明显产生保护作用。二、成功构建了重组腺病毒rAd3E-Fk7和rAd3E-H7Fk7。重组腺病毒rAd3E-Fk7、rAd3E-H7Fk7与野生型腺病毒具有相同的复制曲线。用嵌合腺病毒进行体外中和实验表明,六邻体和纤毛头蛋白能诱导产生针对HAdV-3和HAdV-7的中和抗体。对人血清进行体外中和实验,显示六邻体和纤毛头蛋白能产生HAdV-3或HAdV-7的中和抗体。总之,HAdV-3和HAdV-7中的六邻体蛋白和纤毛头蛋白都可能是诱导中和抗体应答。研究结果对腺病毒疫苗和药物开发有重要意义。三、成功构建了重组人五型腺病毒纤毛头蛋白嵌合型重组人3型腺病毒rAd3E-Fk5。结果显示rAd3E-Fk5病毒在金仓鼠原代细胞内有显著增殖。而rAd3E病毒在金仓鼠原代细胞内没有显著增殖。人3型腺病毒rAd3E对小鼠肾原代细胞感染能力低,而纤毛蛋白嵌合型重组人3型腺病毒rAd3E-Fk5的感染力高,与对照人5型腺病毒rAd5E感染力相近。rAd3E-Fk5在金仓鼠原代细胞内有晚期基因的表达。可以用于人3型腺病毒疫苗评价、抗病毒药物评价、致病机制的小鼠、金仓鼠动物模型中。【结论】一、重组腺病毒rAdMHE3-h55能够在小鼠中诱导免疫应答,并且产生针对HAdV-3、HAdV-7和HAdV-55的抗体。对重组腺病毒疫苗的开发有重要意义。二、HAdV-3和HAdV-7中的六邻体蛋白和纤毛头蛋白都可能是诱导中和抗体应答。因此可能对腺病毒疫苗和药物开发很重要。三、纤毛蛋白嵌合型重组人3型腺病毒rAd3E-Fk5在体外可以感染小鼠肾原代上皮细胞、金仓鼠肾原代细胞,其感染效率与HAdV-5相近,相比其母毒株rAd3E其感染效率要高得多,rAd3E-Fk5在金仓鼠细胞内有显著复制,可以用于人3型腺病毒疫苗评价、抗病毒药物评价、致病机制等动物模型中。
【图文】：

允许 3.5A 分辨率的 X 射线衍射来确定该病毒的结构。病毒结构揭示了内外壳表面上的主要和次要蛋白的位置、折叠和相互作用。如图 1.2 所示，新的结构信息进一步阐明了腺病毒衣壳包装和病毒-宿主细胞相互作用的[47]。

图 1.3 腺病毒的入胞[77] 纤毛和受体结合 五邻体与整联素结合介导内化 病毒经受早期内含体内环境，，释放顶角蛋白 ④pVI 破坏内含体膜致病毒从内含体中逃离 ⑤部分脱壳维管运输到核孔复合体 ⑥在核孔复合体病毒 DNA 脱壳入核
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R373.1

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本文编号：2637581