张应力通过下调miR-503-3p表达靶向增高Wnt7b表达促进人脂肪干细胞成骨分化

发布时间：2020-04-24 01:08

【摘要】：微小RNAs(microRNAs,miRNAs)通过抑制mRNA翻译在间充质干细胞的成骨分化中发挥关键作用,而许多miRNAs的调控机制仍不清楚。在本研究中,我们探讨了miR-503-3p在张应力下调控人脂肪干细胞(human adipose-derived stem cells,hASCs)成骨分化的作用机制。流式细胞仪检测免疫表型实验以及干细胞多向分化潜能实验证实所培养的细胞是hASCs。双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-503-3p直接靶向结合Wnt7b的3'端非翻译区(3'-UTR),以调节其表达水平。张应力下通过miR-503-3p mimic和inhibitor对miR-503-3p表达进行增强或抑制后表明,miR-503-3p的低表达显著促进hASCs的成骨分化,而miR-503-3p过表达则抑制成骨分化。进一步的研究结果表明,miR-503-3p过表达抑制Wnt7b的表达,从而抑制Wnt/β-cantenin途径。相反,miR-503-3p低表达促进Wnt7b的表达,进而激活Wnt/β-cantenin途径。综上所述,我们的研究结果表明张应力抑制了hASCs中miR-503-3p的表达,靶向促进Wnt7b的表达,进而激活Wnt/β-catenin途径,促进hASCs的成骨分化。因此,miR-503-3p是hASCs成骨分化中的负向调节因子。目的:探讨miR-503-3p靶向调控Wnt7b对hASCs成骨分化的影响。本项研究结果将为促进力学因素在组织工程化骨组织构建中的应用提供理论和实验基础。方法:收集患者自愿捐献的人脂肪组织,分离、获取hASCs,经干细胞多向分化及流式细胞术进行干细胞表面标志物初步鉴定后,选取3-5代细胞用于实验。Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测hASCs细胞增殖的影响;流式细胞仪检测其对周期的影响;油红O染色检测hASCs成脂诱导后的成脂分化;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性和茜素红染色测定hASCs成骨诱导后的成骨分化;阿利新蓝染色和检测hASCs成软骨诱导后的成软骨分化;分别对hASCs加载周期性单轴张应力(5%,0.5Hz,2 h/d)6 d;荧光素酶报告基因实验验证Wnt7b是否为miR-503-3p的靶基因;构建Wnt7b-siRNA干扰片段,通过质粒转染hASCs,实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)法检测miR-503-3p的mimic和inhibitor及si-Wnt7b转染效率;分别用qPCR和蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测成骨分化相关的Runt-相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)、ALP、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC)、Wnt7b和β-连环蛋白(β-catenin)的mRNA和蛋白的表达。结果:干细胞多向分化潜能检测及细胞表面标记物鉴定证明分离提取的hASCs为间充质细胞;张应力下hASCs成骨分化增强;Wnt7b是miR-503-3p的靶基因;Wnt7b过表达促进张应力下hASCs成骨分化,而Wnt7b低表达抑制张应力下hASCs成骨分化;上调miR-503-3p抑制张应力下hASCs成骨分化作用,而下调miR-503-3p促进张应力下hASCs成骨分化作用;Wnt7b过表达弥补miR-503-3p mimic的抑制成骨分化功能,而Wnt7b低表达削弱miR-503-3p inhibitor的增强张应力促成骨分化功能。结论:张应力通过下调miR-503-3p表达靶向增高Wnt7b表达促进人脂肪干细胞成骨分化,此结果为促进力学因素在组织工程化骨组织构建中的应用提供理论和实验基础。
【图文】：

图 1 第 3 代人脂肪干细胞的形态学观察（100×）ological observation of passage 3 human adipose-deri胞周期能力胞增殖情况，，绘制生长曲线为“S”的总体形状为 3-6 d，细胞增殖率显著增加时；平台期 2）。

图 2 第 3 代人脂肪干细胞的生长曲线re 2 The growth curve of passage 3 human adipose-derivedste结果（图 3）表明：本实验获取的 hASCs 有 86.93.09% ± 2.64%处于 S/G2 期。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R329.2

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本文编号：2638353