nup155和gle1在斑马鱼心脏发育过程中的功能研究

发布时间：2020-04-24 06:11

【摘要】：心律失常是最为严重的心血管疾病之一,是指心脏节律或是速率失调或者出现障碍导致的一系列疾病。心房颤动是最为常见的心律失常,是一种高致残性和致死性的疾病。目前通过对房颤家系以及病例的遗传学研究和全基因组关联分析的应用,已发现多个房颤致病/易感基因。这些遗传学研究成果为了解房颤的发生提供了一个广阔的视角,对研究如何预防和治疗房颤提供了宝贵的思路。2008年,我们团队通过研究一个房颤家系,发现其致病基因为NUP155。NUP155是首次发现的非离子通道类的房颤致病基因,这一发现为理解房颤的发病机理以及治疗提供了更开阔的视角。GLE1基因是一个保守的mRNA出核转运调控因子。另外,GLE1在转录的起始和终止过程中也发挥重要的作用。有研究报道NUP155和GLE1二者在细胞内是存在着相互作用的,它们在核孔复合体中共同作用发挥调控mRNA出核转运的任务。由此可见,GLE1基因是一个基因转录后调控的关键调控因子。本研究中主要使用斑马鱼作为实验材料,研究nup155和gle1在斑马鱼胚胎心脏发育过程中的作用,以期解析它们在心血管系统的生理功能。分别使用注射MO(Morpholino Oligos)和mRNA来敲低和过表达nup155和gle1,进而探索它们对斑马鱼早期发育过程中心脏的结构和功能的影响,以期望探索nup155和gle1的重要生理功能,这些研究对了解房颤发生的分子机制具有一定的意义。表达谱结果表明nup155的mRNA信号在单细胞期就已经出现。这一结果表明nup155在卵子发生中就开始表达。从二细胞期开始,nup155呈现一个泛表达的情况。通过比对gle1在斑马鱼中的表达谱,发现nup155和gle1表达位置具有高度的一致性。二者在卵子中就开始表达,之后的各个时期均表现出泛表达的现象,这些区域正是早期细胞分裂活动强烈的地方。这些结果表明nup155和gle1的表达伴随着斑马鱼的胚胎发育过程,可能同nup155和gle11调控细胞mRNA的出核转运过程有关,同时这些实验结果还提示nup155和gle1在胚胎发育过程中的重要作用。将心脏单独分离出来进行实时定量PCR检测,发现nup155和gle1在24 hpf,48hpf以及成鱼心脏中均有表达。实验结果还表明nup155和gle1的基因表达下调会影响调控心脏发育的转录因子的表达。nkx2.5在nup155和gle1敲低之后有显著的下调。同时,敲低gle1还会使gata4的表达下调,而二者均不影响hand2的表达。在48 hpf,通过对心肌细胞的标记物cmlc2检测,发现nup155基因敲低后,心室的内径明显的变小,整个形态结构发生了明显的变化。gle1基因敲低后,斑马鱼胚胎表现出了左右不对称发育的表型,心脏的正常的环化受到了影响。进一步的实验表明左右不对称发生过程中的调控因子spaw和pitx2以及特异性显示胰脏的标记物ins的表达也发生了改变。这些结果表明nup155和gle1在心脏发育过程中发挥了重要功能。之后进一步研究了nup155和gle1对于斑马鱼心脏的心率和动作电位的影响。通过记录和分析48 hpf斑马鱼的心率改变,结果发现敲低nup155和gle1的基因表达能够使斑马鱼心率的显著上调。同时通过实时定量PCR检测调控斑马鱼心率的相关基因hcn4,cav1.3,kcnj2和scn5a的表达情况,结果发现hcn4在nup155和gle1基因敲低之后显著下降,这一结果说明nup155和gle1可能是通过hcn4来影响斑马鱼的心率改变的。在房颤的发生过程中一个重要的因素就是心肌细胞动作电位的变化,所以之后对斑马鱼心脏的动作电位进行了检测。结果发现在nup155敲低之后,斑马鱼的动作电位APD_(90)也发生显著下调,而实时定量PCR的结果表明这一过程中nup155可能是通过调控kcnq1表达来实现的。但是敲低gle1基因并未影响斑马鱼动作电位。这些结果表明nup155可能是通过调控离子通道基因hcn4和kcnq1影响斑马鱼心率与动作电位。通过原位杂交检测敲低nup155和gle1基因后胚胎动脉血管的和静脉血管的标记物,结果发现它们的表达均未发生变化,说明nup155和gle1基因可能只影响心脏的发育,而不影响血管发育。在以上实验中,能够使用nup155和gle1 mRNA将敲低nup155和gle1后的表型拯救到正常水平,说明了nup155和gle1 MO作用的特异性。综上所述,研究中发现nup155通过nkx2.5调控了心脏在胚胎发育阶段的形态发生,通过调控hcn4和kcnq1来影响胚胎心脏的心率和动作电位等电生理活动。而这些基因与房颤的发生都密切相关。同时发现与nup155相互作用的gle1也有类似的生理功能,通过nkx2.5和gata4影响心脏在胚胎发育阶段的形态发生,通过调控hcn4影响胚胎心脏的心率。这些结果揭示了nup155和gle1新的生理功能,同时对进一步认识nup155诱导房颤发生的分子机制有一定的指导意义。
【图文】：

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文在鸡和小鼠中，心脏神经嵴（Cardiac neural crests）是颅神经嵴的一个次区域，起源于耳廓和体节 3。对于形成主动脉瓣间隔的形成，将心脏动脉分为体循环和肺循环有巨大的作用[45]。而在斑马鱼中由于没有主动脉瓣间隔，心脏神经嵴起源于体节 1，，主要负责分化为心脏流出道，心室，心房内流入道处的心肌细胞[33]。

过程成为心管融合。两个心室前体群之间的初始接触是在相对靠后的位置建立的（图1.2 C）。接下来，初始连接处后面的心肌细胞彼此连接，形成 V 形。最后，两个群体的最前部连接，形成与中央腔的前边界（图 1.2 D - F）。从背侧观察，这种结构看起来像一圈心房细胞被心房细胞环包围（图 1.2 E）。从侧面看，很明显心肌细胞形成浅锥，其心室顶端在其心房基部上方背侧凸起（图 1.2 F）[46]。（3）心管组建在 24 hpf，心管融合后，心脏继续延伸，逐渐转变为线性心管。通过其顶点朝向胚胎右侧倾斜来启动锥体延伸，然后锥体延长，向后伸展（图 1.2 G- H）。最终，所有心肌细胞合并成具有离散的心室和心房末端的管（图 1.2 I）。随着心管的形成，心内膜细胞形成其内层
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R541.75;R-332

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本文编号：2638621